在适用于临床应用的无血清悬浮细胞培养体系中产生重组腺相关病毒(AAV)载体的可扩展方法技术

公开了用于利用质粒转染细胞的方法和组合物。在某些实施方案中，本发明专利技术公开了其中转染效率通过在转染过程期间使被转导的细胞与不含核酸的聚乙烯亚胺(PEI)接触而显著提高的方法和组合物。还公开了根据所公开的方法和组合物生成的治疗上有用的腺相关病毒载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在适用于临床应用的无血清悬浮细胞培养体系中产生重组腺相关病毒(AAV)载体的可扩展方法相关申请本专利申请要求2015年12月1日提交的美国专利申请No.62/261,815的优先权，所述专利申请全文以引用方式明确地并入本文。
本专利技术涉及利用核酸，例如质粒进行细胞转导(转染)的领域。更具体地讲，本专利技术提供了用于产生转导细胞的组合物和方法，所述细胞任选产生腺相关病毒(AAV)载体。引言整个说明书中引用了数种出版物和专利文献以便描述本专利技术所属领域的现状。这些引用文献中的每一个均以引用方式并入本文，如同全文阐述一样。
技术实现思路
本专利技术提供诸如编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸之类的核酸(质粒)、和聚乙烯亚胺(PEI)、任选地与细胞组合的组合物。在一个实施方案中，组合物包含质粒/PEI混合物，其具有多种组分：(a)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(b)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(c)聚乙烯亚胺(PEI)溶液。在具体方面，质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，并且组分(a)、(b)和(c)的混合物任选地温育约10秒至约4小时的时间段。在其它实施方案中，核酸(质粒)和聚乙烯亚胺(PEI)的组合物还包含细胞。在具体方面，使细胞与组分(a)、(b)和(c)的质粒/PEI混合物接触。在附加的实施方案中，核酸(质粒)和聚乙烯亚胺(PEI)、任选地与细胞组合的组合物，还包含游离PEI。在具体方面，细胞与游离PEI接触。在各种其它实施方案中，细胞与组分(a)、(b)和(c)的混合物接触至少约4小时、或约4小时至约140小时，或约4小时至约96小时。在具体方面，细胞与组分(a)、(b)和(c)的混合物以及任选的游离PEI接触至少约4小时。本专利技术的组合物可存在于容器中。在具体方面，容器为烧瓶、板、袋或生物反应器，并且任选地是无菌的，和/或容器任选地适用于维持细胞活力或生长。本专利技术组合物和方法的质粒尤其包括编码病毒蛋白诸如AAV衣壳蛋白的核酸。此类质粒和细胞可与游离PEI接触。在具体方面，质粒和/或细胞与游离PEI接触至少约4小时、或约4小时至约140小时，或约4小时至约96小时。还提供一种产生转染细胞的方法，所述方法包括：提供质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将所述核酸(质粒)与PEI溶液混合以产生质粒/PEI混合物。在具体方面，将所述质粒/PEI混合物温育约10秒至约4小时范围内的时间段。在此类方法中，将细胞与所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物，然后将游离PEI加入产生的核酸/PEI细胞培养物中以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；并且然后将产生的游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染的细胞。在具体方面，所述质粒包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸。还提供了一种产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生重组AAV载体，所述方法包括：提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将前述质粒与PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内以产生质粒/PEI混合物(并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段)；使细胞与所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到产生的质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；以及将所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染细胞，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。另外提供了用于产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括：提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将前述质粒与PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内以产生质粒/PEI混合物(并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段)；使细胞与本专利技术所述所产生的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到如本专利技术所述产生的质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；将所述质粒/PEI细胞培养物或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；收获产生的转染细胞和/或从产生的转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；并将产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。还提供了用于产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生具有编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。在一个实施方案中，方法包括：提供以下组分的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液；将所述质粒(i)和(ii)与PEI溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物(并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段)；使细胞与产生的质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；以及将所述质粒/PEI细胞培养物或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞，所述转染细胞产生包编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。本专利技术的方法和组合物还包括一个或多个步骤或特征结构。示例性步骤或特征结构包括但不限于，收获产生的转染细胞和/或从产生的转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物的步骤。附加的示例性步骤或特征结构包括但不限限于从细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。此外，还提供产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸。在一个实施方案中，方法包括：提供以下组分的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，将所述质粒(i)和(ii)与所述PEI溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包含质粒/PEI混合物，所述质粒/PEI混合物包含以下组分：(a)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(b)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(c)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，并且其中所述组分(a)、(b)和(c)的混合物任选地温育约10秒至约4小时的时间。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.01 US 62/261,8151.一种组合物，其包含质粒/PEI混合物，所述质粒/PEI混合物包含以下组分：(a)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(b)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(c)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，并且其中所述组分(a)、(b)和(c)的混合物任选地温育约10秒至约4小时的时间。2.根据权利要求1所述的组合物，其还包含细胞。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的所述质粒/PEI混合接触。4.根据权利要求3所述的组合物，其还包含游离PEI。5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述细胞与所述游离PEI接触。6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触至少约4小时。7.根据权利要求3所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约140小时范围内的时间段。8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约96小时范围内的时间段。9.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物和所述游离PEI接触至少约4小时。10.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约140小时范围内的时间段。11.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约96小时范围内的时间段。12.根据权利要求6至11中任一项所述的组合物，其中所述细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含容器，所述容器任选地包括烧瓶、板、袋、或生物反应器，所述容器任选地是无菌的，和/或所述容器任选地施用于维持细胞活力或生长。14.根据权利要求1所述的组合物，其还包含含有编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒。15.根据权利要求14所述的组合物，其还包含与所述组分(a)、(b)和(c)的质粒/PEI混合物和所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒接触的细胞。16.根据权利要求15所述的组合物，其还包含游离PEI，其中所述细胞与所述游离PEI接触。17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物、所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒、和所述游离PEI接触至少约4小时。18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物、所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒、和所述游离PEI接触在约4小时至约140小时范围内的时间段。19.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物、所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒、和所述游离PEI接触在约4小时至约96小时范围内的时间段。20.一种产生转染细胞的方法，所述方法包括：(a)提供质粒；(b)提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；(c)将(a)的质粒与(b)的PEI溶液混合以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约4秒至约4小时范围内的时间段；(d)将细胞与所述步骤(c)的质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；(e)将游离PEI加入所述步骤(d)中产生的所述核酸/PEI细胞培养物中以产生游离的PEI/质粒/PEI细胞培养物；并且(f)将所述步骤(e)的游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染的细胞。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述质粒包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸。22.一种产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体，所述方法包括：(a)提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(b)提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(c)提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；(d)将步骤(a)和(b)的所述质粒与步骤(c)的所述PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；(e)使细胞与步骤(d)的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；(f)将游离PEI添加到步骤(e)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；以及(g)将步骤(f)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染细胞，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。23.根据权利要求20或22所述的方法，其还包括以下步骤：收获步骤(f)或(g)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(f)或(g)中产生的所述转染细胞中收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物。24.根据权利要求22所述的方法，其还包括从步骤(g)的所述细胞和/或培养基收获物中分离和/或纯化重组AAV载体，由此产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。25.一种用于产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括步骤：(a)提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(b)提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(c)提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；(d)将步骤(a)和(b)中的所述质粒与步骤(c)的所述PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；(e)使细胞与步骤(d)中的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；(f)将游离PEI添加到步骤(e)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；(g)将步骤(e)中的所述质粒/PEI细胞培养物或步骤(f)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；(h)收获步骤(g)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(g)中产生的所述转染细胞收获培养基，以产生细胞和/或培养基收获物；并且(i)从在步骤(h)中产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生所述包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。26.一种用于产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体，所述方法包括以下步骤：(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，(b)将所述质粒(i)和(ii)与所述(PEI)溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；(c)使细胞与步骤(b)中产生的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；(d)将游离PEI添加到步骤(c)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；(e)将步骤(c)中的所述质粒/PEI细胞培养物或步骤(d)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞，所述转染细胞产生包括编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。27.根据权利要求25或26所述的方法，其还包括以下步骤：收获步骤(e)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(e)中产生的所述转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；和/或从步骤(e)的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。28.一种产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括以下步骤：(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；以及(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，(b)将所述质粒(i)和(ii)与所述(PEI)溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；(c)使细胞与步骤(b)中产生的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；(d)将游离PEI添加到步骤(c)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；(e)将步骤(c)中的所述质粒/PEI细胞培养物或步骤(d)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；(f)收获步骤(e)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(e)中产生的所述转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；(g)从步骤(f)中产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。29.一种产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括以下步骤：(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；和(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，其中所述质粒(i)和(ii)在约1...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲光，陆林，约翰·弗雷泽·莱特，
申请(专利权)人：星火治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US