The invention discloses a human embryonic stem cell line capable of regulating gene expression and its application. A human embryonic stem cell line capable of regulating gene expression comprises a controlled expression system of exogenous fusion proteins and at least one guide RNA. The controlled expression system of exogenous fusion proteins comprises a tetracycline-induced expression system and a fusion protein composed of a Cas9 protein and a P300 core domain with transcriptional activation activity. The guided RNA is either a 14 BP short sequence targeting the promoter region of the gene or a 20 BP long sequence targeting the genome region. The invention can control the expression of Cas9_p300 in human embryonic stem cells in real time, realize the dual functions of specific gene activation and cleavage at different stages of human embryonic stem cell differentiation, and greatly expand the application of human embryonic stem cells in the fields of medicine and life sciences.
【技术实现步骤摘要】
一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用
本专利技术属于基因工程和生物
,涉及由CRISPR/Cas9介导的可控性激活切割双系统的Cas9-p300人类胚胎干细胞系及其构建方法及其应用。
技术介绍
人类胚胎干细胞是一种多潜能性细胞,来自早期胚胎(4-5d)的内细胞团,具有自我更新和多向分化的潜能。1998年,美国科学家JamesThomson首次体外成功培养人类胚胎干细胞,人类胚胎干细胞的科学研究和临床应用也拉开的帷幕。目前研究中,胚胎干细胞已经成功的分化成滋养层细胞、神经细胞、肝细胞、软骨细胞、造血细胞、心肌细胞等多种细胞,也成功的建立了个体发育模型,同时正在向干细胞的移植来重建机体功能和干细胞基因治疗等临床治疗方向努力发展,虽然胚胎干细胞的研究前景令人很乐观,但是也存在很多困难,如细胞培养技术条件要求高,资金消耗大等问题。CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-Associatedsystems),全名是常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统,是细菌及古生菌的一种获得性免疫系统,能够通过单链RNA识别外源双链DNA,并借助Cas9核酸酶切割外源DNA,抵御外源DNA侵袭。2013年,张锋等科学家首次报道了CRISPR-Cas9系统在哺乳动物基因组编辑中的应用,开启了CRISPR-Cas9强大的基因编辑功能成为生命科学领域的新星,获得广泛研究和应用,近些年针对CRISPR-Cas9系统中的成份进行不同的修饰和更改,如突变Cas9 ...
【技术保护点】
1.一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系,其特征在于,包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA,所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白;所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列。
【技术特征摘要】
1.一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系,其特征在于,包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA,所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白;所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列。2.根据权利要求1所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系,其特征在于,所述基因启动子区位于MYOD1、IL1RN、HBG1、FOXA2、SOX17、NKX2.1和miR145。3.根据权利要求1所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系,其特征在于,所述基因组区域位于CCR5、IL1RN、HBG1和OCT4。4.一种供体表达载体,其特征在于,该表达载体用于表达权利要求1所述的可控表达外源性融合蛋白系统。5.根据权利要求4所述的供体表达载体,其特征在于,其包括以下四个部分:第一部分,控制系统元件,包括CMV启动子,M2rtTA表达序列,SV40polyA;第二部分,融和蛋白表达元件,包括TRE启动子,Cas9-p300表达序列,SV40polyA;第三部分,体内线性化元件,包括位于供体载体两端方向相同的23bp的AAVS1gRNA识别序列;第四部分,抗性筛选元...
【专利技术属性】
技术研发人员:荣知立,林瑛,马淑凤,
申请(专利权)人:南方医科大学,
类型:发明
国别省市:广东,44
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