纯化腺病毒颗粒的方法技术

本发明专利技术提供利用宿主细胞DNA破碎随后进行澄清步骤从高细胞密度悬液大规模纯化腺病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及病毒制备领域。更具体地，本专利技术涉及从细胞悬液纯化腺病毒颗粒的改进方法。
技术介绍
疫苗制备领域近来的进展产生了对大规模生产的需求。亟需稳健和高效的方法来为全世界提供足量的(重组)疫苗以对抗传染病。针对传染病的疫苗可以基于重组腺病毒颗粒。为此进行了大量的努力以优化基于细胞的腺病毒制备方法。将细胞以渐增密度培养，随后感染以获得更高的总病毒收率。这样的高细胞密度方法公开于例如Crucell Holland BV的WO 2010/060719和Yuk etal. (2004)。其中描述了制备高浓度重组腺病毒的方法。这种优化方法依赖于这样的能力，即以高细胞密度(例如，高于5xl06细胞/ml)感染培养物并保留高的每细胞病毒产率。这提供一种在单生物反应器中获得高病毒浓度的收获病毒溶液的方法。所述方法通常的病毒颗粒(VP)收率为约 I. 5-2. 5xl012VP/mL。以高密度培养细胞的方法易于积累大量的细胞碎片和宿主细胞DNA。在纯化过程中必须进一步除去这些污染物，而这是繁琐的操作。US7326555最近公开一种从收获的细胞培养物除去宿主细胞DNA的方法。所述方法由选择性地从细胞培养物沉淀宿主细胞DNA组成。选择性沉淀剂可以特异性地结合宿主细胞DNA，并且不沉淀腺病毒颗粒。然而，该文献中的方法仅对低细胞密度细胞培养物进行描述，其中细胞碎片和宿主细胞DNA存在的量不闻。目前尚未知所述方法可以应用于包含高细胞密度的培养物。相比之下，从现有技术可以推知的强烈建议是，当以高浓度使用时用于所述方法的沉淀剂不会选择性地从培养物沉淀宿主细胞DNA，并且会沉淀病毒颗粒(Goerke et al. 2004)。由于细胞培养方法是放大级别上升的，并且细胞以渐增的密度进行培养，所以工业中亟需允许处理高细胞密度悬液的下游方法。这特别适用于腺病毒制备领域。专利技术概述本专利技术涉及从高细胞密度悬液中纯化来自细胞裂解物的腺病毒颗粒的方法。我们在本文中发现，高细胞密度悬液中的宿主细胞DNA可以从裂解的细胞悬液选择性地沉淀，而留下病毒颗粒不被沉淀。宿主细胞DNA的选择性沉淀用阳离子洗涤剂进行。例如，此前US7326555中描述了低细胞密度悬液中的选择性沉淀。然而，实现高细胞密度悬液中的选择性沉淀尚无先例，并且是很难预期的。在现有技术中，例如在US7326555中，确实证实在低细胞密度悬液中(高达Ix IO6细胞/ml)，腺病毒颗粒在阳离子洗涤剂浓度增加时发生沉淀。根据推测，这表明，大量增加阳离子洗涤剂浓度(例如2倍)会导致存在于悬液中的总体腺病毒颗粒的沉淀。在高细胞密度悬液中，其中细胞密度为例如高10倍因而宿主细胞DNA浓度也高10倍，预期实现宿主细胞DNA沉淀所需的洗涤剂浓度也会明显更高。因此，基于低细胞密度悬液的结果预期，这样的浓度增加的洗涤剂会具有使存在于溶液中的所有病毒颗粒沉淀的效果O在高细胞密度(增加10倍)的实验测试中，我们发现，与基于现有技术任何建议或预期相反，增加浓度的阳离子洗涤剂(增加2. 5倍)确实沉淀宿主细胞DNA(至少80%)，但是不沉淀腺病毒颗粒。令人惊讶的是，洗涤剂的选择性沉淀效果保留下来。本专利技术提供一种可以用于在利用高细胞密度培养物的大规模腺病毒纯化方法中除去宿主细胞DNA的方法。本专利技术提供一种从包含5x106-150x106细胞/ml的细胞悬液中，所述方法包括a)将所述细胞悬液中的细胞裂解；b)通过加入选择性沉淀剂从腺病毒颗粒选择性沉淀宿主细胞DNA ;以及c)将包含所述腺病毒颗粒的悬液澄清以获得纯化的含腺病毒悬液，其中将至少80%的宿主细胞DNA从所述含腺病毒悬液中沉淀。在一些优选的实施方案中，所述病毒纯化自细胞悬液，其具有的细胞密度范围为5xl06-50xl06 细胞/ml，例如 10xl06_50xl06 细胞/ml 或 10xl06_30xl06 细胞/ml。在某些实施方案中，步骤b)中所用的选择性沉淀剂为阳离子洗涤剂。在优选实施方案中，所述选择性沉淀剂为度米芬(DB)。在某些实施方案中，所述选择性沉淀剂添加至浓度范围为I. 2_5mM。在优选实施方案中，所述选择性沉淀剂添加至浓度范围为I. 3-2. 2mM。在某些实施方案中，本专利技术的方法还包括阴离子交换步骤和超滤步骤。附图说明图I :低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(20xl06_30xl06vc/ml)密度细胞悬液中，针对度米芬浓度作图的腺病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。图2 :低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(18xl06-25xl06vc/ml)密度细胞悬液中，针对度米芬浓度作图的腺病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。专利技术详述本专利技术涉及从高细胞密度悬液纯化来自细胞裂解物的腺病毒颗粒的方法。根据本专利技术，所述高细胞密度悬液通过将细胞培养至高细胞密度而获得。这样的培养可以(不限于)批量、供料批量或灌注模式来进行。将细胞培养至高细胞密度的方法为本领域技术人员已知。获得高细胞密度培养物的具体方法公开于，例如W02004/099396、W02005/095578、W02008/006494、WO 2010/060719。根据本专利技术，高细胞密度悬液包含约5x106-150xl06细胞/mL，例如约8x106-120x106 细胞 /mL,如约 12xl06-100xl06 细胞 /mL,如约 20xl06-80xl06 细胞 /mL。在本专利技术的一优选实施方案中，所述高细胞密度悬液的细胞密度为约10x106-50x106细胞/mL，例如至少约15xl06细胞/mL，如至少约20xl06细胞/mL，如至少约25xl06,如高达约30xl06细胞/mL，如高达约35xl06细胞/mL，如高达约40xl06细胞/mL，如高达约45x106细胞/mL。根据本专利技术，用腺病毒颗粒感染高细胞密度培养物以允许所述腺病毒在细胞悬液增殖。在本文中，在单生物反应器中获得高细胞密度悬液，其包含高浓度的腺病毒。感染高细胞密度培养物的方法也是本领域技术人员已知的。获得高病毒浓度的高细胞密度培养物的具体方法公开于，例如EP0816818L 9、Cortin et al. 2004和Yuk et al. 2004。这些参考文献描述了用于制备大量重组腺病毒的方法。这些方法依赖于用每细胞高腺病毒产率的保存物感染高细胞密度的培养物的能力。本文则提供了一种在单生物反应器中获得高腺病毒浓度的高细胞密度悬液的方法。本专利技术方法的典型收率，例如对于重组腺病毒35 (rAd35)为约I. 5-2. 5xl012VP/mL。根据本专利技术，一旦腺病毒在细胞培养物中增殖并杀死大部分细胞，则从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒。本专利技术方法的第一步骤包括将高细胞密度悬液中所包含的细胞裂解。裂解用腺病毒颗粒感染的高细胞密度悬液导致大量细胞碎片和宿主细胞DNA积累在所述细胞悬液中。这些积累使得细胞悬液随后的下游加工冗长繁琐。本专利技术提供一种适合于从高细胞密度悬液的细胞裂解物。通过向细胞裂解物加入选择性沉淀剂可以从高细胞密度悬液中的腺病毒颗粒选择性沉淀大量宿主细胞DNA，从而从包含腺病毒颗粒的高细胞密度悬液沉淀至少约80%的宿主细胞DNA分子。如本文所公开的，在澄清(例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·L·德沃克特，M·维斯特拉，
申请(专利权)人：克鲁塞尔荷兰公司，
类型：发明
国别省市：