一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统及其在无菌无热原蛋白质药物制备上的应用技术方案

本发明专利技术涉及一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统和一种基于该纯化系统的纯化无菌无热原人源化抗CD146单克隆抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质纯化领域。具体地说，本专利技术涉及一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统和一种基于该纯化系统的纯化无菌无热原人源化抗CD146单克隆抗体的方法。
技术介绍
蛋白质药物，相对于传统化学药物，具有特异性强、毒性低，生物学功能明确、有利于临床应用等优点。在蛋白质药物开发过程中，如何将其从成份复杂的表达体系中分离纯化出来，成为一个重要并且不可规避的环节。传统的蛋白质纯化方法，在样品的预处理、层析纯化和剂型工艺等阶段，有许多环节不得不在敞口环境下操作，使样品直接暴露于空气当中，从而大大增加了染菌和混入其他污染物的几率。而无菌、无热原及各项残留指标符合临床标准的蛋白质药物制备，是临床前及临床研究和批量生产中必须实现的。为了获得合格的蛋白质药物，国内外普遍采用在GMP或准GMP洁净环境下进行蛋白质药物的纯化制备这一策略，来排除空气中的悬浮颗粒及菌落所带来的污染。当然，建造GMP或者准GMP的环境，对于临床阶段及上市后大规模生产的蛋白质药物是必要并且必需的。但是，对于处在临床前研究阶段的药物，这将是一笔不小的开支和负担，往往限制了具有潜在治疗价值的蛋白质药物从实验室研究向临床研究的转化。抗体药物，作为当前蛋白质药物中最重要的一类，以其高度的特异性、安全性和有效性，成为国际药物市场上一大类新型治疗剂。至2011年10月，全球共有36个治疗性抗体药物获得批准上市。其中，美国及欧盟批准了 32个(包括日本I个)，中国批准了 3个，德国批准了 I个。这些抗体药物广泛覆盖了肿瘤、炎症、自身免疫性疾病等多种适应症。当前，抗体药物开发策略中，新药物靶点的发现和降低抗体免疫原性，成为了两个研究热点。⑶146，又名MUC18，Mel-CAM/MCAM,是一种属于免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子。CD146胞外有五个免疫球蛋白样结构域(V-V-C2-C2-C2)，并被高度糖基化，介导钙离子非依赖的细胞间相互黏附。CD146最 早发现是黑色素瘤的标志分子，参与黑色素瘤的转移及恶化。CD146在黑色素肿瘤中的异常高表达增强了肿瘤细胞之间的黏附，并对于肿瘤的侵袭和转移非常重要。研究表明，CD146的表达与黑色素瘤细胞的转移能力直接相关，而在不表达CD146的黑色素瘤细胞中过量表达CD146可以显著增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。此夕卜，⑶146也表达在少量的正常组织中，比如平滑肌，血管内皮和滋养层等。抗人CD146抗体在动物实验中表现出了很强的抑制肿瘤生长的治疗效果。据报道，Mills等开发的抗⑶146全人抗体，ABX-MAl在裸鼠模型中显著地抑制黑色素肿瘤的生长、侵袭以及向肺部的转移。另外，如专利技术专利ZL 991075862所述，本课题组开发的抗CD146鼠单克隆抗体AA98具有抑制肿瘤血管生成的作用，并在多种裸鼠荷瘤实验中明显抑制肿瘤的生长。进一步的研究还揭示了 AA98的抑制肿瘤血管生成的机制是通过抑制MAPK磷酸化以及NF B活化实现的。以上结果表明，⑶146是个非常有潜力的抗肿瘤及血管新生相关疾病的药物新靶点。因此，人源化的CD146单克隆抗体的纯化制备工艺开发，成为了将其推向临床首当其冲的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是，为解决临床前研究阶段建立GMP或准GMP环境投入高、风险大的难题，提供一种蛋白质纯化系统，该系统在普通生化实验室环境下，就可以纯化获得无菌无热原及各项残留符合临床指标的蛋白质药物，从而大大降低临床前研究阶段的投入和风险。为实现上述目的，本专利技术提供了一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统。通过该系统，实现了在普通实验室环境下，从样品的预处理到粗纯化、精纯化以至浓缩剂型工艺的全过程封闭操作，达到了中试规模制备无菌无热原蛋白质药物的目的。本专利技术实现全封闭管路化系统的具体技术方案，其特征是:首先，分别建立微滤、蛋白质层析、超滤三类全封闭纯化模块；然后，按照目标蛋白质的纯化工艺路线，依次串联组装为全封闭管路化系统；一般蛋白质的纯化工艺，遵从的是从微滤到蛋白质层析再到超滤的顺序，但也不排除在多步骤层析工艺中，插入一个或者多个超滤浓缩或置换缓冲液的步骤；其中，所述的 蛋白质层析模块，根据不同目标蛋白的不同层析工艺路线，还可以扩展为2个或若干个装填有相同或不同层析介质的模块。所述的层析介质包括:亲和层析介质、离子交换层析介质、疏水层析介质、凝胶过滤层析介质、反向层析介质或/和混合机制层析介质。所述的微滤和超滤模块，由蠕动泵提供动力，以驱使液体在模块内及向下一模块流动。所述的蛋白质层析模块，由其中的层析系统泵提供动力驱使液体在模块内及向下一模块流动；并由层析系统的缓冲液阀和出口阀控制缓冲液和样品的流路及流向。所述微滤、蛋白质层析和超滤模块，通过各模块中储液袋上预留的洗消液体口，定期泵入洗消液进行系统清洗消毒，消除可能存在的内毒素等杂质残留，以保持全封闭管路化系统的清洁，确保蛋白质纯化过程中不会引入外源的污染或多次使用之间的交叉污染。同时，本专利技术还利用所述全封闭管路化蛋白质纯化系统，开发了普适于多种药物蛋白质的，从液态培养表达物中分离纯化药物蛋白质的制备工艺。适用于该纯化工艺的药物蛋白质，应可溶性表达于液态基质中。该纯化工艺具体实施步骤如下:1.微滤澄清步骤，使用中空纤维柱，以切向流滤过的方式，除去液态培养表达物中的大颗粒、可能损害层析介质的杂质。所述中空纤维柱微滤孔径为0.22-0.45 μ m,中空纤维膜面积与批次处理样品体积成正比。2.层析纯化步骤，使用层析介质在相适应的缓冲液条件下，对微滤澄清后的样品进行纯化；大多数药物蛋白质的层析步骤为I步捕获层析和后续的I至多步精细层析纯化；其中所涉及的层析介质可以为亲和层析介质、离子交换层析介质、疏水层析介质、凝胶过滤层析介质、反向层析介质或/和混合机制层析介质；经层析纯化步骤后，获得纯度大于95%、内毒素、宿主蛋白残留和Protein A残留等指标符合临床质量标准的原液。3.超滤浓缩及缓冲液置换步骤，使用中空纤维柱，以截留方式使层析纯化步骤获得的药物蛋白原液获得浓缩，并置换到可稳定保存的缓冲液体系中，最终获得药物蛋白质成品。所述中空纤维柱截留分子量应小于目标蛋白分子量的一半为宜，中空纤维膜面积与批次处理原液体积成正比。此外，在所述全封闭管路化蛋白质纯化系统和药物蛋白质制备工艺基础上，本专利技术还开发了人源化抗⑶146单克隆抗体的纯化制备工艺。所述的人源化抗⑶146单克隆抗体，由CHO细胞经无血清培养体系连续灌流悬浮培养，表达于培养上清中。为获得符合临床质量标准的人源化抗CD146单克隆抗体，本专利技术所述纯化制备工艺采用了四步法的纯化方法:首先，将含有目标抗体的培养上清，经由无菌无热原处理的硅胶管，从细胞培养袋泵入本专利技术所述的全封闭管路化蛋白质纯化系统，经微滤模块的0.45 μ m中空纤维柱过滤，获得澄清的培养上清。然后，澄清的培养上清进入蛋白质亲和捕获层析纯化模块，在中性条件下上柱，经以Protein A为配基的亲和层析介质分离纯化，酸性条件下洗脱，在洗脱组分中获得粗纯化抗体。随后，粗纯化抗体进入蛋白质凝胶过滤精细层析纯化模块，经过SuperdeUOO凝胶过滤层析介质的分离，在洗脱组分中获得纯度大于95%、内毒素、宿主蛋白残留和Protein A残留等指标符合临床质量标准的抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全封闭管路化的蛋白质纯化系统，其特征在于至少包括以下模块：微滤模块，所述微滤模块包括中空纤维柱、补液池、循环流通池和实现密闭连接所需的相应的接头、接头卡箍和导管，所述中空纤维柱的上端和下端分别与所述循环流通池的上下各一个接口密闭连接，所述循环流通池下部的另一个接口与所述补液池的一个接口密闭连接，在连接所述中空纤维柱下端和所述循环流通池下端的导管处设置蠕动泵以提供循环动力，在连接所述循环流通池和所述补液池的导管处设置蠕动泵以提供液体从所述补液池到所述循环流通池的动力；至少一个蛋白质层析模块，所述至少一个蛋白质层析模块中的每一个包括蛋白层析柱、层析系统、洗脱液池、平衡液池、废液收集池和实现密闭连接所需的相应的接头、接头卡箍和导管，所述洗脱液池和所述平衡液池通过所述层析系统的入口多通阀与所述蛋白层析柱密闭连接，所述废液收集池通过所述层析系统的出口多通阀与所述蛋白层析柱密闭连接，该模块由所述层析系统提供动力；和超滤模块，所述超滤模块包括中空纤维柱、循环流通/成品收集池、废液收集池和实现密闭连接所需的相应的接头、接头卡箍和导管，所述中空纤维柱的上端和下端分别与所述循环流通/成品收集池的上下各一个接口密闭连接，所述循环流通/成品收集池的另一个接口作为所述超滤模块的入口，所述中空纤维柱的滤出接口与所述废液收集池密闭连接，在连接所述中空纤维柱下端和所述循环流通池下端的导管处设置蠕动泵以提供循环动力；其中，所述微滤模块与所述至少一个蛋白质层析模块中的第一个之间通过滤出收集/待纯化样品池连接，所述滤出收集/待纯化样品池的一个接口与所述微滤模块的中空纤维柱的滤出接口密闭连接而另一个接口与所述至少一个蛋白质层析模块中的第一个的层析系统的入口多通阀密闭连接；当所述至少一个蛋白质层析模块的数目大于1时，所述至少一个蛋 白质层析模块之间通过纯化样品收集/待纯化样品池连接，所述纯化样品收集/待纯化样品池的一个接口与前一个蛋白质层析模块的出口多通阀密闭连接而另一个接口与后一个蛋白质层析模块的出口多通阀密闭连接；并且所述至少一个蛋白质层析模块中的最后一个与所述超滤模块之间通过纯化样品收集/待超滤样品池连接，所述纯化样品收集/待超滤样品池的一个接口与所述至少一个蛋白质层析模块中的最后一个的出口多通阀密闭连接，而另一个接口与所述超滤模块的入口密闭连接，在连接所述超滤模块的入口和所述纯化样品收集/待超滤样品池的导管处设置蠕动泵以提供液体从所述纯化样品收集/待超滤样品池到所述超滤模块的入口的动力；并且其中，在所述补液池、循环流通池、洗脱液池、平衡液池、废液收集池、循环流通/成品收集池、滤出收集/待纯化样品池、纯化样品收集/待纯化样品池、纯化样品收集/待超滤样品池上预留有洗消液口。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阎锡蕴，王飞，冯静，杨东玲，卢迪，宋丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：