高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法技术

公开了不需要复杂的操作即可定量被检测试样中的高密度脂蛋白3(HDL3)中的胆固醇的方法。HDL3中的胆固醇的定量方法包含使磷脂酶和/或鞘磷脂酶作用于被检测试样，使胆固醇移动至反应体系外的第1工序；和定量残留在反应体系内的胆固醇的第2工序。可以不需要超离心、前处理等复杂的操作，而通过自动分析装置特异性地定量被检测试样中的HDL3胆固醇。此外，也可以根据通过作为现有技术的被测物中HDL总胆固醇定量法而得到的总HDL胆固醇量，计算HDL3胆固醇量的差，从而定量HDL2胆固醇量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及高密度脂蛋白3 (以下有时称为“HDL3”)中的胆固醇(HDL3中的胆固醇以下有时称为“HDL3胆固醇”)的定量方法。
技术介绍
高密度脂蛋白(HDL)胆固醇与由于从包括动脉硬化壁在内的各组织接收胆固醇而蓄积在细胞内的胆固醇的去除作用有关，因此也被称为胆固醇逆向转运体系。已知其与冠状动脉硬化等动脉硬化疾病成负相关，已知HDL为低值时作为血脂异常病的一种而设定有低值界限，作为动脉硬化的指标有用。HDL由载脂蛋白和磷脂、胆固醇、中性脂肪构成。HDL分类为比重为d=1.063 1.210g/mL、进一步 d =1.063 1.125g/mL 的 HDL2 和 d =1.125 1.210g/mL 的 HDL3 的2种组分。根据脂蛋白的分布曲线，在d=1.125部分确认到凹口，从这里开始比重重的部分为HDL3。此外，还存在根据HDL中的载脂蛋白中的载脂蛋白E含量差，将载脂蛋白E的含量多的HDL作为载脂蛋白E-rich HDL的亚组分的分类法。已知不仅现有的所有HDL蛋白，而且HDL2和HDL3各亚组分也显示出不同的作用。已知在临床中，由于CETP缺损，HDL无法代谢成LDL、IDL，HDL胆固醇量增加。由于CETP缺损而增加的HDL为HDL2。HDL2被认为具有抗动脉硬化作用。此外，也被认为由于CETP缺损，载脂蛋白E-rich HDL上升,对于Apo-E — richi HDL,其胆固醇去除能强,具有抗血小板作用，被认为是HDL中的有益蛋白。此外，由于肝脂酶活性的降低，HDL3不变化为HDL2，HDL3增加。启示了 HDL3的增加导致冠动脉疾病的发病率增加。根据这些倾向，推测分别测定HDL亚组分有助于判断动脉硬化疾病的有无、原因。此外，现在各制造商都在进行基于这些HDL亚组分的作用，阻碍CETP作用，使LDL胆固醇量减少，使HDL胆固醇量增加的治疗药的研发。确立HDL亚组分的简便的测定方法可能关系着详细的作用的解明、它们的治疗效果O作为到目前为止已知的HDL亚组分的测定方法，已知有超离心法、高效液相色谱法(HPLC)法、HDL3沉淀法(专利文献I )、NMR法等。超离心是利用脂蛋白的比重差通过离心进行分级的方法，具有操作需要熟练、花费数日、以及费用也高的缺点。对于冈崎等人的使用HPLC分离HDL2和HDL3的方法，操作需要时间，需要特殊的设备。HDL3沉淀法是通过含有2价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂使HDL3以外的物质凝集，通过离心回收上清部分的HDL3，通过自动分析装置进行测定的方法。其也具有操作需要熟练、被测物并且是手动方法而需要被测物的前处理操作、到测定为止需要花费一定的时间等缺点，不通用。此外，NMR法是通过核磁共振测量脂蛋白的粒子数的方法，需要特殊的设备，不常用。需要说明的是，存在 HDL亚组分的分析方法(专利文献2)。可以通过通用自动分析装置测定，使用通过使用表面活性剂阻碍HDL3以外的脂蛋白不受酶的作用的方法，在HDL3反应中，存在目标以外的脂蛋白，在对测定产生影响，或者在未阻碍完全的情况下，有测量到HDL3以外的脂蛋白的可能。需要专利技术代替这样的方法、能够简便且更选择性地定量胆固醇量的试剂。现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开2009-207463号公报 专利文献2:日本特开2001-346598号公报。
技术实现思路
专利技术要解决的问题 本专利技术的目的在于提供一种不需要复杂的操作即可定量被检测试样中的HDL3的方法。解决问题的技术手段 本申请专利技术人经过深入研究，结果发现磷脂酶和鞘磷脂酶作用于脂蛋白，但几乎不作用于HDL3。于是想到，使磷脂酶或鞘磷脂酶作用于被检测试样，消除胆固醇，然后定量残留的HDL3中的胆固醇，从而可以定量被检测试样中的HDL3胆固醇，并实验性地确认了上述想法可以实现，完成了本专利技术。S卩，本专利技术提供一种，其包含使磷脂酶和/或鞘磷脂酶作用于被检测试样，使胆固醇移动至反应体系外的第I工序；和定量残留在反应体系内的胆固醇的第2工序。专利技术效果 根据本专利技术，可以不需要超离心、前处理等复杂的操作，而通过自动分析装置特异性地定量被检测试样中的HDL3胆固醇。此外，也可以根据通过作为现有技术的被测物中HDL总胆固醇定量法而得到的总HDL胆固醇量，计算出HDL3胆固醇量的差，从而定量HDL2胆固醇量。附图说明[图1]是表示在本专利技术的实施例中进`行的、添加第2工序的试剂D后的各组分的吸光度变化的结果的图。[图2]是表示在本专利技术的实施例中进行的、添加第2工序的试剂G后的各组分的吸光度变化的结果的图。[图3]是表示在本专利技术的实施例中进行的、添加第2工序的试剂H后的各组分的吸光度变化的结果的图。[图4]是表示在本专利技术的实施例中进行的、添加第2工序的试剂I后的各组分的吸光度变化的结果的图。[图5]是表示在本专利技术的实施例中进行的、添加第2工序的试剂K后的各组分的吸光度变化的结果的图。[图6]是表示在本专利技术的实施例中进行的、添加第2工序的试剂L后的各组分的吸光度变化的结果的图。具体实施例方式作为供于本专利技术的方法的被检测试样，只要是要定量所述试样中的HDL3胆固醇的被检测试样就没有特别限定，优选为血清或血浆或它们的稀释物，特别优选血清或其稀释物。本专利技术的第I工序中，使磷脂酶和/或鞘磷脂酶(以下，有时将两者统称为“磷脂酶等”)作用于被检测试样。作为磷脂酶，是至少作用于磷脂酰胆碱的磷脂酶即可，优选磷脂酶A、磷脂酶C和磷脂酶D，特别优选磷脂酶C和磷脂酶D。由于磷脂酶等市场上有售，因而可以优选使用市售品。磷脂酶等可以单独使用，也可以组合2种以上使用。磷脂酶等的最终浓度(使用2种以上时为其总浓度，以下相同)优选为0.1 100U/mL左右，更优选为0.2 50U/mL左右。若使磷脂酶等作用于被检测试样，则HDL3几乎不受到作用，而HDL3以外的脂蛋白受到作用，其胆固醇移动至反应体系外。在本专利技术的方法的第I工序中，受到磷脂酶等的作用而使胆固醇移动至反应体系夕卜。这里，“移动至反应体系外”是指，通过消除或保护胆固醇及其酯，使在之后的工序中胆固醇及其酯不参与。这里“消除”是指，将被检测试样中的脂蛋白的胆固醇分解，使其在之后的工序中不作用于测定胆固醇的反应。作为用于消除脂蛋白胆固醇的方法，可以列举出使用过氧化氢酶将使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用而产生的过氧化氢分解成水和氧的方法。此外，也可以使用过氧化酶使供氢体与产生的过氧化氢反应转化为无色醌，但不限定于这些。消除胆固醇的方法本身是该领域中公知的，下述实施例中也有具体的记载。“保护”是指，为了使被检测试样中的脂蛋白在之后的工序中不在胆固醇测定中反应而进行保护。保护脂蛋白可以列举出使用特异性地保护各脂蛋白的表面活性剂以使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶不作用于其的方法，但不限定于这些。第I工序也可以通过预先同时添加用于移动至反应体系外的酶系、表面活性剂，将两工序以单一工序的形式同时进行。第I工序中，在使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情况下，胆固醇酯酶的浓度(本说明书中，浓度在无特别说明时表示最终浓度)优选为0.1 10.0U/mL左右，更优选为0.2 2.0U/mL左右。胆固醇氧化酶的浓度优选为0.05 10.0U/mL左右，更优选为0.1 1.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.23 JP 2010-1663171.高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，其包含使磷脂酶和/或鞘磷脂酶作用于被检测试样，使胆固醇移动至反应体系外的第I工序；和定量残留在反应体系内的胆固醇的第2工序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷脂酶为磷脂酶C和/或磷脂酶D。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在与高密度脂蛋白3以外的脂蛋白反应的表面活性剂的存在下进行所述第I工序。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述表面活性剂为作为聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的至少I种非离子表面活性剂。5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述表面活性剂为选自聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、酰胺醚硫酸盐和聚氧乙烯-硬脂胺中的至少I种阴离子表面活性剂。6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述表面活性剂为选自椰子油脂肪酸一酰胺丙基二甲基-氨基醋酸内铵盐、烷基二甲基-氨基醋酸内铵盐和月桂基甜菜碱中的至少I种两性表面活性剂。7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述表面活性剂为作为月桂基三甲基氯化铵的阳离子表面活性剂。8.根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，在至少与高密度脂蛋白3反应的表面活性剂的存在下进行所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：樋口麻衣子，伊藤康树，
申请(专利权)人：电化生研株式会社，
类型：
国别省市：