富含甘油三酯的脂蛋白中的胆固醇的定量方法以及定量试剂技术

公开了不需要繁杂的操作、更特异性地定量被检试样中的富含甘油三酯的脂蛋白中的胆固醇(TRL‑C)的方法以及试剂。富含甘油三酯的脂蛋白中的胆固醇的定量方法包含：通过使分子量超过50kDa的胆固醇酯酶和表面活性剂产生作用、选择性地消除富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)以外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(1)，和定量残存的TRL中的胆固醇(TRL‑C)的步骤(2)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】富含甘油三酯的脂蛋白中的胆固醇的定量方法以及定量试剂
本专利技术涉及富含甘油三酯的脂蛋白(下文有时称为TRL)中的胆固醇(下文表示为“脂蛋白名称”胆固醇或“脂蛋白名称”-C时，意味着“”内记载的脂蛋白中的胆固醇)的定量方法以及定量试剂。
技术介绍
根据利用超速离心分离的密度的差异，血液中包含的脂蛋白分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(下文有时称为VLDL)、中间密度脂蛋白(下文有时称为IDL)、低密度脂蛋白(下文有时称为LDL)、高密度脂蛋白(下文有时称为HDL)。已知这些脂蛋白的甘油三酯、胆固醇等脂质、蛋白等的含量不同，各自在体内显示不同的作用。TRL是甘油三酯的含量多的脂蛋白的总称，包含乳糜微粒、VLDL、它们的中间代谢产物、残粒(レムナント)样脂蛋白(RLP)，有时也进一步地包含IDL。一直以来已知LDL、RLP与动脉硬化性疾病的相关性，主要在欧美报告了包含IDL的TRL与动脉硬化性疾病的进展更加深入地相关，其受到关注。迄今为止已知的TRL的测定法存在超速离心法、NMR法等。超速离心是通过离心利用脂蛋白的密度差分级的方法，存在需要操作熟练、花费时日、此外费用也变高的缺点。NMR法是通过核磁共振测量脂蛋白的粒子数的方法，需要特殊的机器，不具一般性。TRL-C的其它测定方法可举出计算法。由于TRL也可称为LDL、HDL以外的脂蛋白，因此从总胆固醇值中减去LDL-C和HDL-C而求得。作为LDL-C的测定法，美国疾病管理中心的β-定量法(β-Quantification法，BQ法)成为国际基准法，该方法将密度1.006-1.063g/cm3的脂蛋白作为LDL，因此BQ法的LDL-C中包含IDL-C。因此，在通过计算求得TRL-C时，在应用由BQ法测定的LDL-C的情况下，IDL-C也作为LDL-C被减去。以BQ法为基准开发的其它LDL-C测定法、例如应用Friedewald公式等的情况也同样。在应用这些LDL-C的测定方法的情况下，算出的TRL-C中不含IDL-C，称不上测定所谓的临床意义更高的包含IDL的TRL。因此，需要简便且正确地定量包含IDL的TRL-C的方法以及试剂的专利技术。下文在仅仅记载TRL、TRL-C的情况下，各自意味着包含IDL的TRL、包含IDL-C的TRL-C。另外，专利文献1-3报告了作为TRL-C的一部分的RLP-C的测定方法。它们都是可通过通用自动分析装置测定的方法，但仅测定RLP，与测定全体TRL的本专利技术不同。现有技术文献专利文献专利文献1：专利4456715号公报专利文献2：专利5027648号公报专利文献3：专利5766426号公报。专利技术概述专利技术要解决的课题本专利技术的目的是，提供不需要繁杂的操作、更特异性地定量被检试样中的TRL-C的方法以及试剂。用于解决课题的手段本申请专利技术人进行深入研究，结果发现，通过在表面活性剂存在下、使分子量超过50kDa的胆固醇酯酶作用于包含各种脂蛋白的被检体试样，TRL以外的脂蛋白特异性地产生反应。通过利用这一知识，想到可以不进行分离操作、简便且正确地定量TRL-C，并完成本专利技术。也即，本专利技术如下。[1]TRL-C的定量方法，其包含：通过使分子量超过50kDa的胆固醇酯酶和表面活性剂产生作用、选择性地消除富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)以外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(1)，和特异性地定量残存的TRL中的胆固醇(TRL-C)的步骤(2)。[2][1]中记载的方法，其中，前述步骤(1)中应用的前述表面活性剂包含选自聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种。[3][1]或[2]中记载的方法，其中，在前述步骤(1)中应用的前述表面活性剂是1种的情况下，该表面活性剂是选自HLB值为12-14的聚氧乙烯多环苯基醚的1种，在前述表面活性剂是2种以上的情况下，该表面活性剂包含选自聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种，并且以2种以上表面活性剂全体的HLB值成为12-14的方式组合2种以上的表面活性剂。[4][1]-[3]的任一项中记载的方法，其中，前述步骤(2)在表面活性剂存在下进行，该表面活性剂包含选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化物(ラウリルアルコールアルコキシレート)、聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种。[5][2]-[4]的任一项中记载的方法，其中，前述聚氧乙烯多环苯基醚是选自聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚的至少1种。[6][5]中记载的方法，其中，前述聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚是选自聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的至少1种。[7][1]-[6]的任一项中记载的方法，其中，前述步骤(1)包含使胆固醇酯酶与胆固醇氧化酶产生作用、消除生成的过氧化氢，前述步骤(2)包含使胆固醇酯酶与胆固醇氧化酶产生作用、定量生成的过氧化氢。[8]TRL-C的定量试剂盒，其为用于1-7的任一项中记载的方法的TRL-C的定量试剂盒，其包含用于前述步骤(1)的分子量超过50kDa的胆固醇酯酶、和表面活性剂。[9][8]中记载的试剂盒，其中，前述步骤(1)中应用的前述表面活性剂包含选自聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种。[10][8]或[9]中记载的试剂盒，其中，在前述步骤(1)中应用的前述表面活性剂是1种的情况下，该表面活性剂是选自HLB值为12-14的聚氧乙烯多环苯基醚的1种，在前述表面活性剂是2种以上的情况下，该表面活性剂包含选自聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种，并且以2种以上表面活性剂全体的HLB值成为12-14的方式组合2种以上的表面活性剂。[11][8]-[10]的任一项中记载的试剂盒，其中，前述步骤(2)在表面活性剂存在下进行，前述试剂盒进一步包含选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化物、聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种的前述表面活性剂。[12][9]-[11]的任一项中记载的试剂盒，其中，前述聚氧乙烯多环苯基醚是选自聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚的至少1种。[13][12]中记载的试剂盒，其中，前述聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚是选自聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的至少1种。专利技术的效果通过本专利技术，提供了不需要分离操作、能够利用自动分析装置简便且正确地定量被检试样中的TRL-C的新方法，以及用于该方法的试剂盒。附图简述[图1]是显示利用下述实施例4中记载的本专利技术方法的TRL-C、与利用超速离心法求得的TRL-C的相关关系的图。用于实施专利技术的方式脂蛋白中包含的胆固醇有酯型胆固醇(胆固醇酯)以及游离型胆固醇。本专利技术中仅称为“胆固醇”的情况下包含这两者。欲利用本专利技术的方法定量的TRL-C意味着，合并乳糜微粒(包含乳糜微粒残粒)、VLDL(包含VLDL残粒)和IDL的脂蛋白中的胆固醇，也即密度不足1.019g/cm3的脂蛋白中的胆固醇。供给本专利技术方法的被检试样没有特别限定，只要是欲定量其试样中的TRL-C即可，通常是血液(包含全血、血清以及血浆)等的体液、其稀释物。在应用与本专利技术中的脂蛋白“反应”的表述的情况下，其意味着利用表面活性剂、酶改变脂蛋白的构造，使酶容易作用于内部的胆固醇。对于本专利技术中的步骤(1)，选择性地消除TRL以外的脂蛋白中的胆固醇。此处的“消除”意味着分解胆固醇并且其分解物在随后的步骤(2)中检测不到。选择性地消除TRL以外的脂蛋白中包含的胆固醇的方法可举出，例如，使胆固醇氧化酶、特定的胆固醇酯酶(后述)作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TRL‑C的定量方法，其包含：通过使分子量超过50kDa的胆固醇酯酶和表面活性剂产生作用、选择性地消除富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)以外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(1)，和定量残存的TRL中的胆固醇(TRL‑C)的步骤(2)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.24 JP 2016-1031081.TRL-C的定量方法，其包含：通过使分子量超过50kDa的胆固醇酯酶和表面活性剂产生作用、选择性地消除富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)以外的脂蛋白中的胆固醇的步骤(1)，和定量残存的TRL中的胆固醇(TRL-C)的步骤(2)。2.权利要求1中记载的方法，其中，所述步骤(1)中应用的所述表面活性剂包含选自聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种。3.权利要求1或2中记载的方法，其中，在所述步骤(1)中应用的所述表面活性剂是1种的情况下，该表面活性剂是选自HLB值为12-14的聚氧乙烯多环苯基醚的1种，在所述表面活性剂是2种以上的情况下，该表面活性剂包含选自聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种，并且以2种以上表面活性剂全体的HLB值成为12-14的方式组合2种以上的表面活性剂。4.权利要求1-3的任一项中记载的方法，其中，所述步骤(2)在表面活性剂存在下进行，该表面活性剂包含选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂醚、月桂醇烷氧基化物、聚氧乙烯多环苯基醚的至少1种。5.权利要求2-4的任一项中记载的方法，其中，所述聚氧乙烯多环苯基醚是选自聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚的至少1种。6.权利要求5中记载的方法，其中，所述聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚是选自聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的至少1种。7.权利要求1-6的任一项中记载的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤谦亨，伊海田诚，平尾裕子，伊藤康树，
申请(专利权)人：电化生研株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP