来自动物的单克隆抗体的快速分离制造技术

提供了用于识别候选抗原特异性可变区以及生成可具有所期望的抗原特异性的抗体或抗原结合片段的方法和组合物。例如，在某些方面，描述了确定血清抗体CDR的氨基酸序列和丰度水平的方法。在某些方面，提供了确定抗体可变区序列的核酸序列和频率的方法。而且，本发明专利技术提供识别并生成包含高度表现的CDR的抗体或抗原结合片段的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自动物的单克隆抗体的快速分离相关串请的交叉引用本申请要求分别于2010年5月17日和2010年8月27日提交的美国临时专利申 请第61/345，538和61/377，816号的权益，其全部内容通过引用并入本文。专利技术背景
本专利技术一般涉及抗体分析和产生的领域，例如从免疫的动物发现抗体。更具体地， 其涉及用于识别和/或生产所期望的抗体或抗原结合片段的方法和组合物。其还涉及来自 任何哺乳动物以及更一般地具有导致可溶免疫球蛋白表达的适合的免疫响应并且其免疫 球蛋白基因座的基因信息可得的任何动物的单克隆抗体的识别。_5] 相关领域描述在过去的12年中，癌症治疗性抗体例如赫塞汀(曲妥单抗,抗Her2)、Rituxa(利 妥昔单抗，抗⑶20)、Eribitux/Vectibix (西妥昔单抗/帕尼单抗,抗EGFR)、阿瓦斯丁(抗 VEGF)和其他的开发已经挽救了全世界数以万计的生命。抗体治疗相对于小分子药物提 供了不同优点，即(i)对作用原理更好的了解；(ii)较高的特异性和较少的目标外效果；(iii)可预计的安全性和毒理学概况。目前，在美国有超过200种抗体治疗处于临床试验， 其中大部分用于癌症治疗。单克隆抗体的发现是治疗性抗体开发中非常重要的方面。此外，单克隆抗体广泛 用于多种诊断和分析目的。自35年前由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(Kohler和 Milstein, 1975)以来，已经开发了多种产生MAb的方法。这些方法包括经由EB病毒的基因 重组(Traggiai等人,2004)或逆转录病毒介导的基因转移(Kwakkenbos等人,2010)的B细 胞永生化，通过单细胞PCR克隆V基因(Wrammert等人,2008 ;Mei jer等人,2008)和经由重 组抗体文库的展示和删选的体外发现的方法(Clackson等人，1991 ;Feldhaus等人,2003 ； Harvey 等人，2004 ；Schaff itzel 等人，1999 ；Hosse 等人，2006 ；Mazor 等人，2007 ；Zahnd 等 人,2007 ;Kretzschmar和von Ruden, 2002)。用于抗体发现的体外和体内方法都关键取决 于确定抗原特异性的高通量筛选。近来，使用用于抗原特异性B细胞的高通量确定的软光 刻的微雕技术已经加速了B细胞分析，然而，这是以归因于对抗体V基因扩增和细胞扩增的 需要的可观的技术复杂性为代价的(Jin等人，2009 ；Love等人，2006)。相似地，体外抗体发现技术的成功取决于筛选参数，包括展示平台的性质、抗原浓 度、浓缩期间的结合亲和力、多轮筛选(例如，淘洗或分选)以及重要地取决于合成抗体文 库的设计和多样性(Hoogenboom, 2005 ；Cobaugh 等人，2008 ；Persson 等人，2006)。目前与文库筛选系统例如通过淘洗分离抗体的噬菌体展示结合的展示技术的使 用具有许多显著问题一尤其是通过文库生产的一些抗体可导致表达它们的生物体死亡并 且因此它们不能被简单地检测。存在特别的问题，即当寻找对于来自病原体的抗原的特异 的可能与宿主表达系统(例如大肠杆菌(E. coli))生产的抗体同源的抗体时，重要的抗体 不能被表达时。使用大肠杆菌表达人类抗体文库同样受困于密码子选择的问题一人类特定氨基酸所使用的密码子常常不是大肠杆菌或其他宿主系统中相同氨基酸的最佳密码子。这意味着重要的抗体不能(或至少不能以足够的量)被表达，因为其序列中的密码子在大肠杆菌中高度失效导致在大肠杆菌中不能通读并且全长表达。抗体文库的密码子最佳化明显不是可选的，因为文库首先必须被测序，其使得使用文库的主要优点落空。有对于识别控制疾病上表现出有益效果的生物学相关抗体的急迫需要。哺乳动物将抗体(体液)免疫反应针对抗传染原、毒素或癌细胞。患病的个体产生识别疾病原的循环抗体并且在某些实例中(例如在从感染恢复的患者中或者在处于缓解和中的癌症患者中)，这些抗体在恢复和治疗中起到关键作用。目前没有可获得的识别血液中的循环抗体并且产生对疾病原特异性的并且具有治疗效果的抗体的方法。另一方面，来自不同动物物种的单克隆抗体的分离对于治疗学和诊断学的发展很有价值。分离单克隆抗体的现有方法的主要局限在于它们的应用限于非常小数目的物种。与小鼠和人类相比，不同物种已经进化出了不同的使它们的抗体谱变化的不同方法并且因此可产生识别抗原上不同表位或者显示对特定抗原非常高的亲和力的抗体。例如，本领域中熟知的是来自兔类的抗体通常展示比从小鼠生产的那些高得多的亲和性。目前使用杂交瘤技术从特定物种生产单克隆抗体需要将B细胞通过与来自该物种的骨髓瘤融合而永生化成。发育这些骨髓瘤细胞系是困难并且费时的并且因此仅存在于小鼠、灵长类、兔和绵羊。可选择地，研究者已经试图通过将小鼠骨髓瘤细胞系与来自其自体骨髓瘤细胞系不可获得的动物的B细胞融合产生种间杂交瘤。然而，种间杂种以非常低的效率产生并且不稳定，在几代之后停止产生单克隆抗体。因此，目前从具有适当的免疫球蛋白系统的动物中的绝大多数产生单克隆抗体是主要挑战。而且，即使是对于可产生稳定的B细胞融合的物种(兔、小鼠、绵羊和灵长类)，使用杂交瘤技术分离单克隆抗体是动物处死之后需要2-6个月的长期过程。可选择地，单克隆抗体可从来自免疫动物的免疫球蛋白谱的可变(V)链的巨大的文库体外分离并且之后通过不同的展示方法例如噬菌体展示、酵母展示或细菌展示来筛选这些文库。这些方法的使用再一次受限于其免疫球蛋白谱的全面信息可得的几个物种，即小鼠、灵长类和兔。这是因为免疫球蛋白谱的克隆需要能够获得能够将经由无性系重组机制在该动物产生的免疫球蛋白可变区的大部分优选地全部扩增的成套的寡核苷酸引物。其反过来需要在特定物种中表达的免疫球蛋白的序列的全面信息并且其对于具有编码抗体的体液免疫系统的动物中的大部分来说都是不可得的。此外，不知道通过组合文库筛选分离的抗体是否对应于已经通过免疫系统扩增并且在动物中大量生产的那些。明显地，所有这些技术在某种程度上是复杂的、有困难的并且费时的。因此，还有对开发用于识别抗原特异性抗体或直接来自患者或任何动物的单克隆抗体的更有效和精确的方法的需要。专利技术概述本专利技术的方面通过提供确定血清抗体序列或识别来自血清、B细胞或直接来自淋巴组织或来自分离的B细胞的富有抗体序列的新方法来克服本领域中的主要缺陷。因此，在第一实施方案，提供了用于识别循环系统中富有抗体序列的方法，包括a)确定所受对象的含血清样品中的抗体的VH和VL序列的至少互补决定区3 (CDR3)的氨基酸序列，以提供血清抗体序列JPb)识别相对其他血清抗体序列表现阈值水平丰度的抗体序列。“含血清样品”意指包括任何血液相关样品，例如含血清样品、血浆样品或具有添加剂的血液样 品。在某些方面，所确定的氨基酸序列包含完整的VH和VL区的序列。在第二实施方案中，提供了用于产生一种或多种抗体或抗原结合片段的方法，包 括a)获得在所受对象的血清中存在的抗体的VH和VL区的至少CDR3的抗体氨基酸序列 的序列和丰度信息山)识别表现出至少阈值水平丰度的那些序列；和(3)产生包括所确定的 富有氨基酸序列中的一种或多种的一种或多种抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.17 US 61/345,538;2010.08.27 US 61/377,8161.一种确定循环系统中的抗体序列的方法，包括 a)获得由所受对象的成熟B细胞编码的VH和VL基因谱的核酸以及相应的氨基酸序列信息； b)获得来源于所述所受对象的血清抗体的肽的质谱；和 c)使用所述序列信息和所述质谱确定循环系统中一个或多个抗体的VH和VL区的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的方法,其中所述成熟B细胞来自外周血。3.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟B细胞来自淋巴器官。4.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括确定由所述成熟B细胞编码的VH和VL基因的核酸序列以及相应的氨基酸序列。5.如权利要求4所述的方法，其中所述成熟B细胞中的所述核酸序列是通过高通量DNA测序确定的。6.如权利要求5所述的方法，其中所述高通量测序包括边合成边测序、边连接边测序、变杂交边测序、单分子DNA测序、多聚合酶群落测序、纳米孔测序或其组合。7.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟B细胞包括记忆B细胞。8.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟B细胞包括浆细胞。9.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括使用高效液相色谱(HPLC)。10.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)进一步包括分离或富集所选择类型的血清抗体。11.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)进一步包括分离或富集与预定抗原结合的血清抗体。12.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)进一步包括分离或富集血清抗体中含CDR3的片段。13.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)进一步包括使用基于所述序列信息所确定的蛋白酶从血清抗体制备含CDR3的肽片段。14.如权利要求1所述的方法，其中所述所受对象患有肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或者已经被免疫。15.如权利要求1所述的方法，其中所述所受对象具有或者已经被暴露于为感染剂、肿瘤抗原、肿瘤细胞或自身抗原的抗原。16.如权利要求1所述的方法，进一步包括报告步骤c)中的确定。17.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述血清抗体的氨基酸序列的丰度水平。18.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括识别至少具阈值水平丰度的抗体序列。19.如权利要求18所述的方法，其进一步包括生成包含一个或多个的所述富有氨基酸序列中的一种或多种抗体或抗原结合片段。20.如权利要求19所述的方法，其中每个所生成的抗体或抗原结合片段中包含相似丰度的氨基酸序列的VH和VL或者是相似丰度的高同源性氨基酸序列簇的一部分。21.如权利要求19所述的方法，其中步骤c)中生成的抗体或抗体结合片段以IOOpM至.5 μ M的单价亲和性结合所述所受对象具有或者已经被暴露于的抗原。22.如权利要求19所述的方法，其进一步包含评估所生成的抗体或抗原结合片段对预定抗原的结合亲和性。23.—种识别循环系统中富有抗体序列的方法，包括 a)在所受对象的含有血清的样品中确定相应于抗体的VH和VL区的氨基酸序列以提供血清抗体序列；和 b)识别相对于其他血清抗体序列表现出至少阈值水平丰度的抗体序列。24.如权利要求23所述的方法，其中步骤a)包括获得来源于所述所受对象的血清抗体的肽的质谱。25.如权利要求23所述的方法，其中所确定的氨基酸序列包括完整的VH和VL区的序列。26.如权利要求25所述的方法，其中所确定氨基酸序列包括完整抗体V结构域的序列。27.如权利要求26所述的方法，其中确定完整抗体V结构域的序列包括配对相似丰度的VH和VL区、基于同源性比对配对VH和VL区或基于亲和测定配对VH和VL区。28.如权利要求23所述的方法，其中确定相应于所述VH和VL区的氨基酸序列包括确定所述VH和VL区的至少互补决定区3 (⑶R3)的氨基酸序列。29.如权利要求23所述的方法，其中步骤a)进一步包括使用基于所述所受对象的成熟B细胞中VH和VL基因的至少CDR3的核酸序列和相应的氨基酸序列的序列信息确定的蛋白酶从血清抗体制备含CDR3的肽片段。30.如权利要求23所述的方法，其中步骤a)进一步包括获得所述所受对象的成熟B细胞中VH和VL基因的至少CDR3的核酸序列的序列信息，其中所述核酸序列信息被用于确定所述血清抗体的氨基酸序列。31.如权利要求30所述的方法，其中获得所述核酸序列信息包括确定所述B细胞中的核酸序列以及相应的氨基酸序列。32.如权利要求31所述的方法，其中所确定的核酸序列包括VH和VL基因的序列。33.如权利要求31所述的方法，其中所述B细胞中的核酸序列通过高通量DNA测序来确定。34.如权利要求33所述的方法，其中所述高通量测序包括边合成边测序、边连接边测序、变杂交边测序、单分子DNA测序、多聚合酶群落测序、纳米孔测序或其组合。35.如权利要求30所述的方法，其中所述成熟B细胞包括记忆B细胞。36.如权利要求30所述的方法，其中所述成熟B细胞包括浆细胞。37.如权利要求23所述的方法，其中步骤a)进一步包括分离或富集所选择类型的血清抗体。38.如权利要求23所述的方法，其中步骤a)进一步包括分离或富集与预定抗原结合的血清抗体。39.如权利要求23所述的方法，其中步骤a)进一步包括分离或富集血清抗体中含CDR3的片段。40.如权利要求23所述的方法，其中所述方法包括通过自动化方法确定所述血清抗体的氨基酸序列的丰度水平。41.如权利要求40所述的方法，其中确定所述氨基酸序列的丰度水平包括质谱定量方法。42.如权利要求23所述的方法，其中所述阈值丰度水平是约5至约500μ g/ml的浓度。43.如权利要求23所述的方法，其中所述丰度的阈值水平是所述血清抗体中50个最富有的含CDR3的氨基酸序列中的任何一个的水平。44.如权利要求23所述的方法，其中所述所受对象患有肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或者已经被免疫。45.如权利要求23所述的方法，其中所述所受对象具有或者已经被暴露于为感染剂、肿瘤抗原、肿瘤细胞或自身抗原的抗原。46.如权利要求23所述的方法，其进一步包括报告步骤a)中的确定或步骤b)中的识别。47.如权利要求23所述的方法，其进一步包括步骤c)，即生成包含一个或多个的所述富有氨基酸序列中的一种或多种抗体或抗原结合片段的。48.如权利要求47所述的方法，其中每个所生成的抗体或抗原结合片段中包含相似丰度氨基酸序列的VH和VL。49.如权利要求47所述的方法，其中步骤c)中所生成的抗体或抗原结合片段以约IOOpM至5 μ M的单价亲和性与所述所受对象具有或已经被暴露于的抗原结合。50.如权利要求47所述的方法，其中所述步骤c)包括在异源系统中的表达或体外蛋白合成的使用。51.一种生成一种或多种抗体或抗原结合片段的方法，包括 a)获得相应于所受对象的血清中存在的抗体的VH和VL区的抗体氨基酸序列的序列和丰度信息； b)识别表现出如富有氨基酸序列的至少阈值水平丰度的那些序列；和 c)生成包含一个或多个所确定的富有氨基酸序列的一种或多种抗体或抗原结合片段。52.如权利要求51所述的方法，其中步骤a)包括确定所述血清抗体的VH和VL区的至少⑶R3的氨基酸序列。53.如权利要求52所述的方法，其中步骤a)包括获得来源于所述血清抗体的肽的质54.如权利要求52所述的方法，其中所确定的氨基酸序列包括完整VH和VL区的序列。55.如权利要求54所述的方法，其中所确定的氨基酸序列包括完整抗体V结构域的序列。56.如权利要求55所述的方法，其中确定完整抗体V结构域的序列包括将为相似丰度序列的VH和VL区配对；基于同源性比对配对VH和VL区或基于结合测定配对VH和VL区。57.如权利要求51所述的方法，其中获得相应于VH和VL区的抗体氨基酸序列的序列和丰度信息包括获得所述VH和VL区的至少互补决定区3 (CDR3)的抗体氨基酸序列的序列和丰度信息。58.如权利要求52所述的方法，其中步骤a)进一步包括使用基于所述所受对象的成熟B细胞中的VH和VL基因的至少CDR3的核酸序列和相应的氨基酸序列的序列信息识别的蛋白酶从血清抗体制备含CDR3的肽。59.如权利要求52所述的方法，其中步骤a)进一步包括获得所述所受对象的成熟B细胞所编码的VH和VL基因谱的至少CDR3的核酸序列的序列信息，其中所述核酸序列信息被用于确定所述血清抗体的氨基酸序列。60.如权利要求59所述的方法，其中获得所述氨基酸序列信息包括确定所述B细胞中的核酸序列和相应的氨基酸序列。61.如权利要求60所述的方法，其中所确定的核酸序列包括VH和VL基因的序列。62.如权利要求60所述的方法，其中所述B细胞中的核酸序列通过高通量DNA测序来确定。63.如权利要求62所述的方法，其中所述高通量测序包括边合成边测序、边连接边测序、变杂交边测序、单分子DNA测序、多聚合酶群落测序、纳米孔测序或其组合。64.如权利要求59所述的方法，其中所述成熟B细胞包括记忆B细胞。65.如权利要求59所述的方法，其中所述成熟B细胞包括浆细胞。66.如权利要求51所述的方法，其中步骤a)进一步包括分离或富集所选择类型的血清抗体。67.如权利要求51所述的方法，其中步骤a)进一步包括分离或富集与预定抗原结合的血清抗体。68.如权利要求51所述的方法，其中步骤a)进一步包括分离或富集血清抗体的含CDR3的片段。69.如权利要求51所述的方法，其中步骤a)进一步包括通过血清抗体的蛋白水解片段化产生的肽序列的丰度水平。70.如权利要求69所述的方法，其中确定所述氨基酸序列的丰度水平包括质谱的定量方法。71.如权利要求51所述的方法，其中所述丰度的阈值水平是约5至约500μ g/ml的浓度。72.如权利要求51所述的方法，其中所述丰度的阈值水平是所述血清抗体中50个最富有的含CDR3的氨基酸序列中的任何一个的水平。73.如权利要求51所述的方法，其中所述所受对象患有肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病或者已经被免疫。74.如权利要求51所述的方法，其中所述所受对象具有或者已经被暴露于为感染剂、肿瘤抗原、肿瘤细胞或自身抗原的抗原。75.如权利要求51所述的方法，其进一步包括报告步骤b)中的识别。76.如权利要求51所述的方法，其中步骤c)中生成的抗体或抗原结合片段中的每一种包括相似丰度的VH和VL的氨基酸序列。77.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：赛·雷迪，葛新，丹尼·布齐，安德鲁·D·埃林顿，爱德华·M·马科特，贾森·拉维德尔，乔治·乔治乌，
申请(专利权)人：得克萨斯系统大学董事会，
类型：
国别省市：