本发明专利技术公开了一种PCⅢ型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：PCⅢ校准品，PCⅢ校准品浓度为0，20，50，100，200，500ng/mL，校准品稀释液为含有5%牛血清的生理盐水溶液；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的PCⅢ抗体；PCⅢ抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；PCⅢ质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明专利技术还公开了本发明专利技术试剂盒的制备方法。本发明专利技术试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明专利技术还具有检测样品的浓度范围宽、成本低、稳定性好等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体的，本专利技术提供了一种III型前胶原(PCΠΙ)磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
组织中存在五种胶原(1、I1、II1、IV、V型)。正常肝脏中主要含1、II1、IV、V型前胶原，是肝细胞外间质结缔组织增生的主要胶原蛋白。PC III由细 胞内合成后分泌到血液中，P III P是PC III降解后的氨基端肽片段，仅有PC III的1/10，分子量45000，肝纤维化时，纤维母细胞合成PCIII增加，而降解减少。慢活肝和肝硬化时肝纤维合成代谢旺盛，血清PCIII升高，因此有活动性纤维化时，血清PC III升高明显，但陈旧性肝纤维化或晚期肝硬化、肝萎缩时却不一定升高。肝脏在仅有炎症、坏死时，PIIIP也可相应升高。(I)PC III血中含量随慢迁肝、慢活肝、到肝硬化(代期)依次升高，无论P III P或PC III血清浓度与肝活检纤维化严重程度呈高度正相关，是诊断肝纤维化和早期诊断肝纤维化的灵敏标志物。(2)作为肝纤维化分级的指标。(包括肝炎后、酒精性和其他原因引起的肝硬化);(3)作为肝硬化(代偿期)早期治疗和疗效观察的可靠指标；(4)肝硬化晚期(失代偿期)，血PC III含量可有下降。目前常用的检测III型前胶原(PCIII)的方法有放射免疫分析技术(RIA)和酶联免疫分析法(ELISA)，但是这两种方法存在诸多不足，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，其中磁微粒化学发光免疫检测技术，是当今最为敏感的微量免疫测定法。但是磁微粒化学发光分析方法还没有广泛用于PC III的检测，特别是广泛用于临床。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供PC III的磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是=PCIII型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括PC III校准品，PC III校准品浓度为0，20，50，100,200,500ng/mL梯度浓度，校准品稀释液为含有5%牛血清的生理盐水溶液；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的PCIII抗体；PCIII抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ ^ 3. 0，活性> 250U/mL ;PC III质控品，所述质控品包括低值质控品和高值质控品，浓度分别是42. 5 57. 5ng/mL和255 345ng/mL ;化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为O. 7g/L鲁米诺，O. 165g/L对碘酚，缓冲液为pH8. 6的5mmol/L Tris · HCl，避光保存；B液为O. 675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径l-2um。进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。试剂盒的制备方法，包括以下步骤( I )PC III校准品的配制将PC III纯品用含有5%牛血清的生理盐水溶液，浓度分别为 O,20,50,100,200,500ng/mL。 (2) PC III质控品的配制将PC III抗原用含有5%牛血清的生理盐水溶液分别稀释至低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)的允许范围，分别为42. 5 57. 5ng/mL和255 345ng/mL。(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备取IOOmLO. lmol/L 2_吗啉乙磺酸溶液(MES溶液)，依次加入IOmg磁性颗粒和3mg链酶亲和素(SA)，搅拌30min，然后加入10mg/mL的EDC溶液(1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基，又名碳二亚胺盐酸盐溶液)3. 5uL，反应Ih后，使用磁力架吸附，静止lOmin，移去液体，加入IOmL O. Olmol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0. Olmol/L PBS定溶至IL即可。(4)生物素-PC III抗体结合物的制备I)取0. 5mgPC III抗体，用硼酸盐缓冲液在2 8°C下透析I 3h。2)将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜(DMS0)，其终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡。3)在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化铵溶液，常温避光反应30 60min。4)用0. OIM PBS溶液在2 8°C下透析2d，期间换液3 5次。(5) PC III抗体酶结合物的制备采用高碘酸钠氧化法将PC III抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至1:8000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2 8°C。酶稳定剂是一种可以保持蛋白质在冻干或溶液下保持天然折叠构想的试剂，有利于抗原或抗体的保存，避免外界因素如温度、pH、盐、金属离子及其他污染物影响其稳定性。(6) 20倍浓缩洗液的配制按照下述配方配制浓缩洗液，58g/L磷酸氢二钠，5. 92g/L磷酸二氢钠，180g/LNaCl，10mL/L Tween-20, l%0 Proclin300。(7)化学发光液A液和B液的配制0. 7g/L 鲁米诺，0. 165g/L 对碘酚，缓冲液为 5mmol/L Tris · HCl (ρΗ8·6);Β 液为0. 675g/L过氧化脲,用工艺用水配制。(8)组装将上述试剂组装成盒，储存于2 8°C。(9)对采用该方法制的试剂盒进行方法学评价。本专利技术的原理是，本试剂盒采用夹心法原理测定血清或血浆中的PC III，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素-PC III抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-PC III抗体复合物，加入样本和酶后，会通过抗原抗体反应，形成了磁微粒-亲和素-生物素-PC III抗体-PC II1-PC III抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值(RLU)。样本的发光值与样本中PC III浓度呈正相关。样本中的PC III浓度依据由校准品PC III浓度和对应的RLU建立的Log (X)-Log (Y)数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的PC III含量。本试剂盒将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，与以微孔板为固相载体的III型前胶原(PCIII)化学发光试剂盒相比，具有以下优势(I)以磁微粒为固相载体，大大增加了抗体的有效包被量，节约了抗体的用量，从而节约了成本；(2)以磁微粒为固相载体包被抗体，增加了抗原-抗体的接触面积，及发光面积，提高了反应的灵敏度；(3)反应在液相中进行，且利用旋转磁场使磁微粒其搅拌作用，大大缩短了反应时间；(4)在反应过程中引入了生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, 本文档来自技高网...
【技术保护点】
PCⅢ型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1）PCⅢ校准品；PCⅢ校准品浓度为0，20，50，100，200，500ng/mL梯度浓度，校准品稀释液为含有5%牛血清的生理盐水溶液；2）偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；3）生物素标记的PCⅢ抗体；4）PCⅢ抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；5）PCⅢ质控品，所述质控品包括低值质控品和高值质控品，浓度分别是42.5~57.5ng/mL和255~345ng/mL；6）化学发光液A液和B液；7）20倍浓缩洗液；8）反应管。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘萍，范利花，
申请(专利权)人：博奥赛斯天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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