草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法技术

本发明专利技术涉及草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；洗涤酶标板以及对底物显色；对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。本发明专利技术的有益效果是：为检测草鱼中肿瘤坏死因子alpha的蛋白表达水平提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及酶联免疫检测(ELISA)生物

技术介绍
肿瘤坏死因子alpha (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a )是一种重要的细胞因子。早在30多年前，Carswell等人发现了一种存在于血清中，能抑制和杀伤某些肿瘤细胞，并使体内肿瘤发生出血坏死的蛋白物质，被命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor, TNF)。研究发现,肿瘤坏死因子alpha参与和调控机体的免疫功能和炎症反应,发挥促进细胞生长、分化、凋亡等重要作用。自从牙鲆中克隆出第一个肿瘤坏死因子alpha基因的全长cDNA序列开始，肿瘤坏死因子alpha在鱼类中的研究开始受到重视，研究表明鱼类肿瘤坏死因子alpha表现出极大的功能差异说明其功能具有种属特异性，因此有必要对草鱼肿瘤坏死因子alpha在草鱼中的功能检测和应用进行研究。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，英文名Grass carp，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等。加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其调节机制十分重要。由于肿瘤坏死因子alpha在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，因此检测肿瘤坏死因子a在草鱼中的功能对草鱼免疫系统的研究以及鱼类疾病的治疗密切相关。同时，由于鱼类肿瘤坏死因子alpha与哺乳动物和两栖动物的肿瘤坏死因子a分子在结构和功能方面存在较大差距，不能用其他种族的肿瘤坏死因子alpha蛋白和抗体代替鱼类肿瘤坏死因子alpha进行研究，加之鱼类肿瘤坏死因子alpha抗体的缺乏使对肿瘤坏死因子alpha功能地位的研究陷入瓶颈。目前尚没有专门检测草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度的酶联免疫反应方法。
技术实现思路
本专利技术的目的针对现有检测草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度方法的不足，通过重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白制备多克隆抗体，并成功建立，为研究肿瘤坏死因子alpha的功能提供了基础方法。本专利技术的技术方案是，其特征在于，包括如下步骤步骤1:确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2 :建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤步骤21 :包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；步骤22 :封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；步骤23 :制备酶标抗体与抗原混合液；步骤24 :将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；步骤25 :洗涤酶标板以及对底物显色；步骤26 :对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值(0D)，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。本专利技术的有益效果是以重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为包被抗原，采用多克隆抗体，建立了草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白检测竞争抑制酶联免疫检测方法，为检测草鱼中肿瘤坏死因子alpha的蛋白表达水平提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。附图说明图1是草鱼肿瘤坏死因子alpha ELISA检测的标准曲线。图2是采用本专利技术的方法检测草鱼头肾白细胞中肿瘤坏死因子alpha蛋白的分泌结果。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的说明。一种，利用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体(草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体)，再用辣根过氧化物酶(HRP)标记该多克隆抗体得到HRP标记草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体(以下简称酶标抗体)。最后再次采用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为包被抗原和酶标抗体从而建立草鱼肿瘤坏死因子alpha (TNFa )的竞争抑制酶联免疫(ELISA)检测方法。上述重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的获取过程可以利用本申请人之前递交的中国专利技术专利申请(申请号=201210240601.0，名称一种草鱼肿瘤坏死因子a基因的重组表达方法)合成，将草鱼肿瘤坏死因子alpha的基因序列克隆到原核表达载体pET30a(+)(一种商业化的克隆载体)上，构建重组表达质粒pET30a (+) -gcTNF a载体，再将构建得到的重组表达质粒pET30a(+)-gcTNF-a载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)(—种商业化的实验用菌种)中，进行筛选鉴定和测序验证后，将获得的阳性克隆作为工程菌株；将筛选所得的含有工程菌株的菌液，以异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，将菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用含6XHis单克隆抗体或镍离子的亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得高纯度的重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白。由于本步骤的具体过程已经在专利申请201210240601. 0中陈述，因此该步骤不再详细介绍，并且本步骤的目的是获取重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白，本领域的普通技术人员应该意识到，采用其他的能够获取重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的现有方法也是可行的。上述利用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体的过程是一个公知的现有过程，因此不再详细介绍；本领域的普通技术人员应该意识到，采用其他种类的兔子也是可行的。上述利用辣根过氧化物酶(HRP)标记草鱼肿瘤坏死因子alpha抗体得到HRP标记多克隆抗体的方法具体采用马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体(马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒购自ThermoScientific公司)。该方法是一个公知的现有技术，因此不再详细介绍。在具备上述前提材料后，本专利技术的具体步骤如下步骤1:确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；本实施例中，该步骤经过棋盘滴定法确定竞争抑制酶联免疫检测时酶标抗体的最适稀释倍数为1:2000，包被抗原浓度为g/ml，每孔滴加IOOii L。步骤2 :建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程又包括如下步骤步骤21 :包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原(即肿瘤坏死因子alpha蛋白)。本实施例中，该步骤的具体操作过程为用抗原稀释液(pH为9. 6的0. 05M(mol/L)碳酸盐缓冲液)稀释草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白(2 ii g/ml/孔)成为包被液,用包被液包被96孔酶标板，每孔加入包被液体积为100 yl。4°C条件下包被过夜后甩干，用洗涤液(pH为7. 4的0.1M磷酸盐缓冲液中含0. 05%Tween-20，PBST)洗涤三次(每次300 U I/孔)，每次3分钟。步骤22 :封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位。本实施例中，用封闭液(pH为7. 4的0.1M PBS稀释5%脱脂奶粉、0. 3%牛血清白蛋白溶液)室温封闭2小时,每孔加封闭液300 ii I。步骤23 :制备酶标抗体与抗原混合液。本实施例中，用抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤：步骤21：包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；步骤22：封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；步骤23：制备酶标抗体与抗原混合液；步骤24：将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；步骤25：洗涤酶标板以及对底物显色；步骤26：对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值（OD），根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：周红，陈丹燕，张安英，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：