蛋白演化的新方法技术

本发明专利技术涉及蛋白和蛋白演化的新方法。本发明专利技术还涉及鉴定和定位由模板多肽形成或基于模板多肽的突变多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在一个具体方面，本专利技术涉及蛋白和通过蛋白演化产生蛋白。
技术介绍
通过定点诱变的蛋白工程，以及最近的分子演化已经成功地在工业应用上使用以提高酶的属性以及其在抗体中的治疗属性。诸如热稳定性、最适pH、对映选择性、特异性和结合亲和力的特性都已经得以改变以便更好地适应蛋白和抗体的特异性目的。从最初开始，就有许多不同的分子演化方法被描述并应用于提高靶蛋白的特性。例如，可产生并筛选单个点突变的组以获得高表达型突变体。然后可对有益的单个氨基酸 替换进行重组和筛选以进一步优化靶分子中所期望的特性。然而，从单个点突变开始成功地演化靶分子的要求是，性能上(有时)微小的变化能够被准确地测量出来以便确定所述高表达型突变体。在不存在敏感性试验的情况下，无法成功地筛选出单个点突变。能够做到几个位点同时突变，但是所产生的组合数目迅速增加并达到克隆效率和筛选能力的限度。专利技术概述本专利技术涉及鉴定和定位(mapping)由模板多肽形成或基于模板多肽的突变多肽的综合性方法。通常，所述多肽将包括η个氨基酸残基，其中所述方法包括(a)生成η个单独的多肽组，每组包含在所述多肽的单个预定位置具有X个不同预定氨基酸残基的多肽成员；其中每组多肽在所述单个预定位置不同，其通过测序或其他技术确定；检测每组中的至少一种以及优选两种预定的属性、特性或活性；(b)确定每个成员相对于所述模板多肽而言在所述属性、特性或活性方面的任何变化；和(C)绘制反应这些变化的功能图谱。所产生的不同多肽成员的数目等于nXX。在可选的方法中，所述方法包括生成含有突变多肽组的单个群。在这个实施方案中，对整个群进行测序、表达检测和功能筛选，确定单个成员，以及优选地，生成功能图谱。通常，在使用了每个天然存在的氨基酸的情况下，X可为19(表示20个天然存在的氨基酸残基，并排除在所述模板多肽给定位置上出现的特定残基)。然而，完全可使用任何氨基酸亚组，且每个多肽组可被用于整个群的总数X的所有或其亚组替换。任何突变或合成方法均可用于产生突变体的组。在一个实施方案中，所述多肽的产生包括(i)对于每个待诱变的密码子，用63-倍简并寡核苷酸使编码模板多肽的含有密码子的多核苷酸进行基于聚合酶的扩增，其中每个63-倍简并寡核苷酸由第一同源序列和简并的N，N，N三联体序列组成，从而产生子代多核苷酸的组；以及(ii)使所述子代多核苷酸组进行克隆扩增，从而使所述子代多核苷酸编码的多肽得以克隆、测序、表达和筛选。在一个实施方案中，对整个多肽进行综合性诱变。在另一个实施方案中，选择一个或多个区进行综合性诱变。在这种情况下，η表示所述模板多肽的亚组或区。例如，当所述多肽为抗体时，对整个抗体或所述抗体的一个或多个互补决定区(CDR)进行综合性诱变。因而，本专利技术包括定位由具有至少一个(优选6个)互补决定区(OTR)的模板抗体形成的突变抗体组的方法，所述CDR —起包括η个氨基酸残基，所述方法包括(a)生成η个单独的抗体组，每组包含在所述CDR的单个预定位置具有X个不同预定氨基酸残基的抗体成员；其中每组抗体在所述单个预定位置不同；且所产生的不同抗体成员的数目等于nXX；(b)通过测序或其他方法确认每个抗体成员均已产生；(c)表达每个抗体成员；(d)检测每组中的至少一种预定的属性、特性或活性；(e)针对每个成员确定其相对于所述模板多肽在属性、特性或活性方面的任何变化；以及(f)绘制这些变化的结构位置图。对于抗体，所述预定的属性、特性或属性可为结合亲和力和/或免疫原性。如上所述，在可替代的方案中可产生包括所有突变抗体组的单个群。此外，本专利技术提供制备由具有至少一个互补决定区(OTR)的模板抗体形成的突变抗体组的方法，所述CDR包括η个氨基酸残基，所述方法包括(a)生成η个单独的抗体组，每组包含在所述CDR的单个预定位置具有X个不同预定氨基酸残基的抗体成员；其中每组抗体在所述单个预定位置不同；且所产生的不同抗体成员的数目等于nXX。在另一个实施方案中，抗体包括6个⑶R，所述⑶R —起包括η个氨基酸残基。 本专利技术一个实施方案包括通过上述方法绘制的功能位置图(EvoMap )。在另一个实施方案中，某些残基，尤其是对变化敏感的残基可标示于所述EvoMap 上。可通过在这些敏感位置以外的位置产生另外的突变改变来实施进一步优化。在一个具体的实施方案中，通过测序或一些其他方法确认本专利技术的综合性演化技术中产生的突变。附图说明图1说明如何使用综合性定位演化(CPE )产生分子特异性数据库(EvoMap )。图2所示为EvoMap 的实施例和如何通过协同演化来实施另外的优化。图3所示为在同样的哺乳动物细胞系中的，相比野生型IgG的表达水平，源自Fe密码子变体库的全长IgG的表达水平。图4所示为综合性定位插入(CPI )演化的示意图。图5表示演化方法的一种结合对来自CPI 演化的加长的核酸进行综合性定位演化(CPE ),并用于生成分子特异性数据库(EvoMap )。图6所示为综合性定位缺失(CPD )演化的示意图。图7表示演化方法的另一种结合对来自CPD 演化的缩短的核酸进行综合性定位演化(CPE ),并用于生成分子特异性数据库(EvoMap ) 0图8所示为可用于组合来自CPE 的高表达型突变体的综合性定位合成(CPS )的示意图。图9所示为设想的三维(EvoMap )示意图。术语的定义为了便于理解本文提供的实施例，将对某些反复出现的方法和/或术语进行说明。本文使用的术语“制剂”表示多肽、多肽的混合物、空间定位化合物阵列(an arrayof spatially localized compounds)(例如，VLSIPS妝阵列、多核苷酸阵列和/或组合小分子阵列)、生物大分子、噬菌体肽展示库、噬菌体抗体(例如，scFv)展示库、多核糖肽库或来自生物材料，如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织的提取物。通过包括下文所述的筛选试验来评价制剂作为抗肿瘤药物、抗炎药物或细胞凋亡调节剂的潜在活性。通过包括下文所述的筛选试验来评价制剂作为特异性蛋白相互作用抑制剂(即选择性抑制两个预定的多肽之间的结合相互作用，但并不严重干扰细胞活力的制剂)的潜在活性。本文使用的术语“氨基酸”是指任何含有氨基(-NH2)和羧基(-C00H)的有机化合物；优选作为自由基团或聚合后作为肽键的一部分。“二十个自然编码的多肽形成的α -氨基酸”在本领域中应理解为且是指丙氨酸(ala或Α)、精氨酸(arg或R)、天门冬酰胺(asn或N)、天门冬氨酸(asp或D)、半胱氨酸(cys或C)、谷氨酸(glu或E)、谷氨酰胺(gin或Q)、甘氨酸(gly或G)、组氨酸(his或H)、异亮氨酸(ile或I)、亮氨酸(leu或L)、赖氨酸(Iys或K)、蛋氨酸(met或M)丙氨酸(phe或F)、脯氨酸(pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(thr或T)、色氨酸(trp或W)、酪氨酸(tyr或Y)和缬氨酸(val或V)。术语“扩增”是指多核苷酸的拷贝数增加。本文使用的术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白分子以及能够结合抗原表位的免 疫球蛋白分子片段，如Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv和SCA片段。可使用本领域众所周知的方法制备这些保留了一定的选择性结合由抗原衍生的抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰·M·谢特，
申请(专利权)人：生物蛋白有限公司，
类型：
国别省市：