杀昆虫蛋白及其使用方法技术

本公开提供了用于防治害虫的组合物和方法。所述方法涉及用编码杀昆虫蛋白的核酸序列转化生物体。具体地，所述核酸序列可用于制备具有杀昆虫活性的植物和微生物。因此，本公开提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是细菌菌种的杀昆虫核酸和蛋白。所述序列可用于构建表达载体以用于后续转化到包括植物的感兴趣的生物体中，用作分离其他同源(或部分同源)基因的探针。所述杀虫蛋白可用于防治、杀灭下列害虫种群或抑制下列害虫种群生长：鳞翅目(Lepidopteran)、鞘翅目(Coleopteran)、双翅目(Dipteran)、真菌、半翅目(Hemipteran)和线虫类，还可用于产生具有杀昆虫活性的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】以电子方式递交的序列表的引用创建于2014年8月28日且大小为576千字节的文件名为“5345PCT_sequence_listing.txt”的序列表以计算机可读形式与本说明书同时提交。该序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
本公开涉及分子生物学领域。本公开提供了编码杀虫蛋白的新型基因。这些杀虫蛋白以及编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂并且可用于产生转基因抗虫害植物。
技术介绍
使用微生物剂如真菌、细菌或者另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治，可提供具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言，生物杀虫剂的使用造成的污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀昆虫剂的特征性靶标特异性更高的靶标特异性。另外，生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济产量。已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些菌种对于一系列昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫害虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)害虫及其他害虫。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacilluspopilliae)是迄今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。一直以来，还认为昆虫致病性是由幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)这些细菌的菌株引起的。微生物杀昆虫剂，特别是那些由芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂，已在农业方面作为害虫化学防治的替代方案，发挥了重要作用。本领域已对作物进行遗传工程改造，使作物产生由芽孢杆菌分泌的杀虫蛋白，由此开发出了昆虫抗性增强的作物。例如，本领域已对玉米和棉花植株进行遗传工程改造，使这些植株产生从Bt菌株中分离出的杀虫蛋白。这些经遗传工程改造的作物目前在农业中广泛应用，给农场主提供了替代传统昆虫防治方法的环境友好的方案。虽然已证明这些经遗传工程改造的抗昆虫作物在商业上十分成功，但它们仅对较窄范围内的经济上重要的昆虫害虫具有抗性。在一些情况下，昆虫可产生对不同杀昆虫化合物的抗性，使得有必要寻找替代性生物防治剂来防治害虫。因此，仍然需要针对昆虫害虫具有不同范围杀昆虫活性的新杀虫蛋白，例如对于鳞翅目和鞘翅目的多种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述多种昆虫包括但不限于已对现有杀昆虫剂产生抗性的昆虫害虫。
技术实现思路
本公开提供了将杀虫活性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包含编码杀虫和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、含有那些核酸分子的载体以及含有所述载体的宿主细胞。组合物还包含杀虫多肽序列以及那些多肽的抗体。核酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，该DNA构建体或表达盒用于在生物体(包括微生物和植物)中转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以为设计用于在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体地，本公开提供了编码假单胞菌(Pseudomonas)杀昆虫蛋白-72(PIP-72)多肽的分离的或重组的核酸分子，该多肽包含氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸插入、氨基酸片段以及它们的组合。此外，本公开还涵盖与PIP-72多肽对应的氨基酸序列。本公开提供了能够编码SEQIDNO：849所示PIP-72多肽，以及该多肽的氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸插入、氨基酸片段以及它们的组合的分离的或重组的核酸分子。本公开还涵盖与本文实施方案中的核酸序列互补的核酸序列，或杂交至本文实施方案中的序列的核酸序列。本公开还提供了分离的或重组的SEQIDNO：849所示PIP-72多肽，以及该多肽的氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸插入、氨基酸片段以及它们的组合。本公开提供了用于产生所述多肽的方法，以及使用这些多肽防治或杀灭鳞翅目害虫、鞘翅目害虫、线虫类害虫、真菌害虫和/或双翅目害虫的方法。所述实施方案的转基因植物表达本文所公开的杀虫序列中的一者或多者。在各种实施方案中，所述转基因植物还包含具有昆虫抗性的一个或多个另外的基因，例如，用于防治鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫害虫的一个或多个另外的基因。本领域技术人员应当理解，所述转基因植物可包含赋予感兴趣的农艺性状的任何基因。还包括用于检测样本中的所述实施方案的核酸和多肽的方法。本公开还提供了一种试剂盒，用于检测样本中是否存在PIP-72多肽，或是否存在编码PIP-72多肽的核苷酸序列。所述试剂盒可连同执行检测预期因子的方法所需的所有试剂和对照样本以及使用说明一起提供。所述实施方案的组合物和方法可用于产生害虫抗性或耐受性增强的生物体。这些生物体和包含这些生物体的组合物对农业生产非常有用。本文实施方案中的组合物也可用于产生具有杀虫活性的改变或改善的蛋白质，或可用于检测产物或生物体内是否存在PIP-72多肽或核酸。附图说明图1示出了下列物质的氨基酸序列比对：PIP-72Aa(SEQIDNO：2)，PIP-72Ba(SEQIDNO：4)，PIP-72Ca(SEQIDNO：6)，PIP-72Cb(SEQIDNO：8)，PIP-72Da(SEQIDNO：10)，PIP-72Db(SEQIDNO：12)，PIP-72Dc(SEQIDNO：14)，PIP-72Ea(SEQIDNO：16)，PIP-72Fa(SEQIDNO：18)，GBP_A3175(SEQIDNO：20)，SRBS_294080(SEQIDNO：22)，JG43047(SEQIDNO：24)，SwiRh_4910(SEQIDNO：26)，PIP-72Ff(SEQIDNO：28)，PFL_6283(SEQIDNO：30)，PIP-72Gb(SEQIDNO：32)，XBJ1_1078(SEQIDNO：34)，plu2373(SEQIDNO：36)，和PIP-72Ge(SEQIDNO：38)。图中突出显示了序列差异。PIP-72Aa(SEQIDNO：2)中第37至51位氨基酸(基序1)带下划线。图2示出了下列物质的氨基酸序列比对：PIP-72Aa(SEQIDNO：2)，PIP-72Ab(SEQIDNO：927)，PIP-72Ba(SEQIDNO：4)，PIP-72Bb(SEQIDNO：928)，PIP-72Ca(SEQIDNO：6)，PIP-72Cb(SEQIDNO：8)，WP_030131237(SEQIDNO：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含异源核酸分子的DNA构建体，所述异源核酸分子编码对西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)具有杀昆虫活性的PIP‑72多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.13 US 61/8776251.一种包含异源核酸分子的DNA构建体，所述异源核酸分子编码对西方玉米根虫
(Diabroticavirgiferavirgifera)具有杀昆虫活性的PIP-72多肽。
2.根据权利要求1所述的DNA构建体，其中所述编码的PIP-72多肽包含与SEQIDNO：2
具有至少50％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的DNA构建体，其中所述编码的PIP-72多肽与SEQIDNO：2所
示的相应氨基酸相比，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、45、46、47、48、
49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、
76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或86位处包括1至45个氨基酸取代。
4.根据权利要求1或2所述的DNA构建体，其中所述编码的PIP-72多肽与SEQIDNO：2所
示的相应氨基酸相比，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、56、58、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、
81、82、83、84、85或86位处包括1至45个氨基酸取代。
5.根据权利要求1、2或4所述的DNA构建体，其中所述编码的PIP-72多肽包含下式所示
的氨基酸序列：
其中
第2位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Ile、Lys、Leu、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或
Tyr；
第3位处的Xaa是Ile或Trp；
第4位处的Xaa是Thr、Ala、Asp、Glu、His、Ile、Lys、Leu、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；
第5位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Gly、His、Ile或Tyr；
第6位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Trp或
Tyr；
第7位处的Xaa是Asn、Ala或Val；
第8位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr
或Val；
第9位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Gly或Thr；
第10位处的Xaa是Ser、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或
Trp；
第11位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Ser、Thr、
Val或Tyr；
第12位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、
Val、Trp或Tyr；
第13位处的Xaa是Ile、Asn、Gln或Val；
第14位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Phe、His、Lys或Gln；
第15位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Ile、Met或Arg；
第17位处的Xaa是Ile、Glu或Val；
第18位处的Xaa是Asn或Ser；
第19位处的Xaa是His、Ala、Glu、Lys、Leu、Pro、Arg、Ser或Tyr；
第20位处的Xaa是Trp、Ala或Thr；
第22位处的Xaa是Ser、Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、
Thr、Val或Tyr；
第23位处的Xaa是Asp、Ala、Gly、His、Lys、Met、Asn、Gln、Ser、Thr或Val；
第24位处的Xaa是Gly、Asp或Phe；
第25位处的Xaa是Asp、Ala、Glu、Phe、Asn或Gln；
第26位处的Xaa是Thr、Glu或Pro；
第27位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Asn、Gln、Arg或Thr；
第28位处的Xaa是Phe、Pro、Trp或Tyr；
第29位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Ile、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr；
第30位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、
Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；
第31位处的Xaa是Val、Ile或Leu；
第32位处的Xaa是Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、
Thr、Val、Trp或Tyr；
第33位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、
Ser、Thr、Val或Tyr；
第34位处的Xaa是Gly、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；
第35位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Asp、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或
Val；
第36位处的Xaa是Gln、Ala、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr或
Val；
第37位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val；
第38位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、
Ser、Val、Trp或Tyr；
第39位处的Xaa是Trp或Phe；
第40位处的Xaa是Asp、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、
Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第42位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、
Thr、Val、Trp或Tyr；
第44位处的Xaa是Ser、Ala、Asp、Glu、Gly、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val或Tyr；
第45位处的Xaa是Arg、Lys或Ser；
第46位处的Xaa是Gly、Ala或Gln；
第47位处的Xaa是Phe、Cys、Val或Tyr；
第48位处的Xaa是Val、Ile或Leu；
第49位处的Xaa是Leu、Cys、Phe、Met、Arg或Tyr；
第50位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Ile、Met、Pro、Gln、Thr或Val；
第51位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Met或Val；
第52位处的Xaa是Lys、Cys、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr；
第53位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、
Thr、Val或Tyr；
第54位处的Xaa是Asn、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Lys、Met、Gln、Arg、Ser或Trp；
第56位处的Xaa是Ala、Gly、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr；
第57位处的Xaa是Gln、Glu、Leu、Met、Ser或Thr；
第58位处的Xaa是His、Ala、Asp、Phe、Leu、Met、Asn、Arg、Trp或Tyr；
第60位处的Xaa是Tyr、Glu或Phe；
第63位处的Xaa是Gln、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Thr、Val或Tyr；
第64位处的Xaa是Ala、Phe、Gly、His、Arg、Ser或Tyr；
第65位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Thr或Val；
第66位处的Xaa是Ser、Ala或Gly；
第67位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、
Val、Trp或Tyr；
第68位处的Xaa是Ile、Asp、Leu或Val；
第69位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或
Tyr；
第70位处的Xaa是Val、Cys或Ile；
第71位处的Xaa是Asp、Ala、Cys、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Val或Tyr；
第72位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或
Trp；
第73位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Ser、Thr、Val或Tyr；
第74位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或
Tyr；
第75位处的Xaa是Val、Cys、Ile或Leu；
第76位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Phe、His、Ile、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第77位处的Xaa是Asp、Tyr；
第78位处的Xaa是Gln、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、
Val或Tyr；
第79位处的Xaa是Gly、Arg、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、
Thr、Trp或Tyr；
第80位处的Xaa是Arg、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Ser、Thr、Val或Tyr；
第81位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr或Val；
第82位处的Xaa是Ile、Ala、Leu、Met、Arg或Val；
第83位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、
Thr、Val或Tyr；
第84位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Glu、Ile、Ser、Val、Trp或Tyr；
第85位处的Xaa是Leu、Cys、Gly或Val；并且
第86位处的Xaa是Ser、Ala、Ile、Thr或Val。
6.根据权利要求1、2或3所述的DNA构建体，其中所述编码的PIP-72多肽包含下式所示
的氨基酸序列：
其中
第2位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Ile、Lys、Leu、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或
Tyr；
第3位处的Xaa是Ile、Leu、Val或Trp；
第4位处的Xaa是Thr、Ala、Asp、Glu、His、Ile、Lys、Leu、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；
第5位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Gly、His、Ile、Leu或Tyr；
第6位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Trp或
Tyr；
第7位处的Xaa是Asn、Ala或Val；
第8位处的Xaa是Asn、Lys、Gly、Ser、Gln、Arg、Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met
或Val；
第9位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Gly或Thr；
第11位处的Xaa是Asn、Lys、Thr、Gln、Arg、Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、
Met、Val或Tyr；
第12位处的Xaa是Pro、Thr、Lys、Ser、Arg、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Asn、Gln、
Arg、Val、Trp或Tyr；
第13位处的Xaa是Ile、Asn、Gln、Leu或Val；
第14位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Phe、His、Lys、Asp或Gln；
第15位处的Xaa是Val、Ala、Ile、Leu、Cys、Met或Arg；
第16位处的Xaa是Ala或Ser；
第17位处的Xaa是Ile、Glu、Leu或Val；
第18位处的Xaa是Asn、Gln、Thr或Ser；
第19位处的Xaa是His、Lys、Ala、Arg、Glu、Leu、Pro、Ser或Tyr；
第20位处的Xaa是Trp、Ala或Thr；
第21位处的Xaa是Gly、Arg或Lys；
第22位处的Xaa是Ser、Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、
Thr、Val或Tyr；
第23位处的Xaa是Asp、Ala、Gly、His、Lys、Met、Asn、Gln、Ser、Thr或Val；
第24位处的Xaa是Gly、Asp或Phe；
第25位处的Xaa是Asp、Ala、Glu、Phe、Asn或Gln；
第26位处的Xaa是Thr、Glu、Asp、Ser或Pro；
第27位处的Xaa是Ser、Thr、Lys、Arg、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Asn或Gln；
第28位处的Xaa是Phe、Tyr、Pro或Trp；
第29位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Ile、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr；
第30位处的Xaa是Ser、Gly、Lys、Thr、Arg、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Leu、Met、Asn、
Pro、Gln、Val、Trp或Tyr；
第31位处的Xaa是Val、Ile、Met或Leu；
第32位处的Xaa是Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、
Thr、Val、Trp或Tyr；
第33位处的Xaa是Asn、Ser、Gln、Pro、Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、
Leu、Arg、Val或Tyr；
第34位处的Xaa是Gly、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；
第35位处的Xaa是Lys、Glu、Ala、Cys、Asp、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、
Thr或Val；
第36位处的Xaa是Gln、Ala、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr或
Val；
第37位处的Xaa是Glu、Asp、Ala、Cys、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val；
第38位处的Xaa是Thr、Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、
Arg、Val、Trp或Tyr；
第39位处的Xaa是Trp或Phe；
第40位处的Xaa是Asp、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、
Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第42位处的Xaa是Ser、Asn、Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Arg、
Val、Trp、Tyr或Gln；
第44位处的Xaa是Ser、Asp、Ala、Leu、Thr、Glu、Ile、Ala、Gly、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、
Val、Tyr或Val；
第45位处的Xaa是Arg、Lys或Ser；
第46位处的Xaa是Gly、Ala或Gln；
第47位处的Xaa是Phe、Tyr、Cys、Val或Trp；
第48位处的Xaa是Leu、Met、Ile、Cys、Phe、Met、Arg、Tyr或Val；
第49位处的Xaa是Leu、Met、Ile或Val；
第50位处的Xaa是Ser、Ala、Tyr、Cys、Asp、Ile、Met、Pro、Gln、Val或Thr；
第51位处的Xaa是Leu、Val、Ala、Cys、Met或Ile；
第52位处的Xaa是Lys、Cys、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、Gln、Trp或Tyr；
第53位处的Xaa是Lys、Arg、Met、Leu、Ile、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Asn、Gln、Ser、
Thr、Tyr或Val；
第54位处的Xaa是Asn、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Lys、Met、Gln、Arg、Ser或Trp；
第55位处的Xaa是Gly、Ser或Thr；
第56位处的Xaa是Ala、Thr、Gln、Ser、Gly、Leu、Pro、Arg或Asn；
第57位处的Xaa是Gln、Glu、Leu、Met、Ser、Val、Ala、Asn、Ile或Thr；
第58位处的Xaa是His、Ala、Lys、Asp、Phe、Leu、Met、Asn、Arg、Trp、Tyr或Thr；
第59位处的Xaa是Pro、Thr或Ser；
第60位处的Xaa是Tyr、Glu或Phe；
第62位处的Xaa是Val、Ile或Leu；
第63位处的Xaa是Gln、Ser、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Thr、Val或Tyr；
第64位处的Xaa是Ala、Gln、Asn、Phe、Gly、His、Arg、Ser或Tyr；
第65位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Val或Thr；
第66位处的Xaa是Ser、Ala或Gly；
第67位处的Xaa是Lys、Gln、Asn或Arg；
第67位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、
Val、Trp或Tyr；
第68位处的Xaa是Ile、Asp、Leu或Val；
第69位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或
Tyr；
第70位处的Xaa是Val、Ile、Cys或Leu；
第71位处的Xaa是Asp、Glu、Tyr、Ala、Cys、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Val或
Trp；
第72位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、
His或Trp；
第73位处的Xaa是Asn、Ser、Asp、Gln、Thr、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Val、Tyr或
Glu；
第74位处的Xaa是Ala、Thr、Met、Ile、Lys、Ser、Leu、Val、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Asn、
Gln、Tyr或Arg；
第75位处的Xaa是Val、Cys、Ile或Leu；
第76位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Phe、His、Ile、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第77位处的Xaa是Asp、Tyr；
第78位处的Xaa是Gln、His、Ser、Asn、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Arg、
Val、Tyr或Thr；
第79位处的Xaa是Gly、Arg、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、
Thr、Trp或Tyr；
第80位处的Xaa是Arg、Glu、Gln、Lys、Asp、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Ser、Thr、
Val、Tyr或Asn；
第81位处的Xaa是Leu、Pro、Thr、Ile、Val、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His或Ser；
第82位处的Xaa是Ile、Ala、Leu、Met、Arg和Val；
第83位处的Xaa是Glu、His、Asn、Leu、Gln、Ile、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、Lys、Pro、Arg、
Ser、Thr、Tyr或Val；
第84位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Glu、Ile、Ser、Val、Trp或Tyr；
第85位处的Xaa是Leu、Val、Cys、Gly或Ala；并且
第86位处的Xaa是Ser、Ala、Tyr、Asn、Ile、Val或Thr。
7.根据权利要求1、2、3和4中任一项所述的DNA构建体，其中所述编码的PIP-72多肽包
含由下列序列中的第37位至第51位表示的氨基酸基序：SEQIDNO：846、SEQIDNO：847、
SEQIDNO：848或SEQIDNO：849。
8.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含：
编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽与下列氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高的序列同一性：SEQIDNO：20、SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：
26、SEQIDNO：30、SEQIDNO：34、SEQIDNO：36、SEQIDNO：929、SEQIDNO：930、SEQID
NO：931、SEQIDNO：937、SEQIDNO：938、SEQIDNO：942、SEQIDNO：947或SEQIDNO：
948；和
异源调控序列，其中所述多核苷酸可操作地连接至所述异源调控序列。
9.一种包含编码嵌合PIP-72多肽的嵌合核酸分子的DNA构建体，所述嵌合PIP-72多肽
包含至少第一部分和第二部分，所述第一部分包括第一PIP-72多肽部分，所述第二部分包
括互补的第二PIP-72多肽部分，其中所述第一PIP-72多肽和所述第二PIP-72多肽在所述相
应的部分中具有不同的氨基酸序列。
10.一种包含核酸分子的分离的多核苷酸，所述核酸分子编码对西方玉米根虫
(Diabroticavirgiferavirgifera)具有杀昆虫活性的PIP-72多肽。
11.根据权利要求10所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的PIP-72多肽包含与SEQ
IDNO：2具有至少50％同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求10或11所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的PIP-72多肽与SEQ
IDNO：2所示的相应氨基酸相比，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、45、
46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、
73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或86位处包括1至45个氨基酸取代。
13.根据权利要求10或11所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的PIP-72多肽与SEQ
IDNO：2所示的相应氨基酸相比，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、
20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54、56、58、60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、
78、79、80、81、82、83、84、85和86位处包括1至45个氨基酸取代。
14.根据权利要求10、11和13中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的PIP-72
多肽包含下式所示的氨基酸序列：
其中
第2位处的Xaa是Gly、Ala、Cys、Asp、Glu、Ile、Lys、Leu、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或
Tyr；
第3位处的Xaa是Ile或Trp；
第4位处的Xaa是Thr、Ala、Asp、Glu、His、Ile、Lys、Leu、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr；
第5位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Gly、His、Ile或Tyr；
第6位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Trp或
Tyr；
第7位处的Xaa是Asn、Ala或Val；
第8位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr
或Val；
第9位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Gly或Thr；
第10位处的Xaa是Ser、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr或
Trp；
第11位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Ser、Thr、
Val或Tyr；
第12位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、
Val、Trp或Tyr；
第13位处的Xaa是Ile、Asn、Gln或Val；
第14位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Phe、His、Lys或Gln；
第15位处的Xaa是Val、Ala、Cys、Ile、Met或Arg；
第17位处的Xaa是Ile、Glu或Val；
第18位处的Xaa是Asn或Ser；
第19位处的Xaa是His、Ala、Glu、Lys、Leu、Pro、Arg、Ser或Tyr；
第20位处的Xaa是Trp、Ala或Thr；
第22位处的Xaa是Ser、Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、
Thr、Val或Tyr；
第23位处的Xaa是Asp、Ala、Gly、His、Lys、Met、Asn、Gln、Ser、Thr或Val；
第24位处的Xaa是Gly、Asp或Phe；
第25位处的Xaa是Asp、Ala、Glu、Phe、Asn或Gln；
第26位处的Xaa是Thr、Glu或Pro；
第27位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Asn、Gln、Arg或Thr；
第28位处的Xaa是Phe、Pro、Trp或Tyr；
第29位处的Xaa是Phe、Ala、Cys、Ile、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr；
第30位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、
Arg、Thr、Val、Trp或Tyr；
第31位处的Xaa是Val、Ile或Leu；
第32位处的Xaa是Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、
Thr、Val、Trp或Tyr；
第33位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、
Ser、Thr、Val或Tyr；
第34位处的Xaa是Gly、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Tyr；
第35位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Asp、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或
Val；
第36位处的Xaa是Gln、Ala、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr或
Val；
第37位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val；
第38位处的Xaa是Thr、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、
Ser、Val、Trp或Tyr；
第39位处的Xaa是Trp或Phe；
第40位处的Xaa是Asp、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、
Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第42位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、
Thr、Val、Trp或Tyr；
第44位处的Xaa是Ser、Ala、Asp、Glu、Gly、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val或Tyr；
第45位处的Xaa是Arg、Lys或Ser；
第46位处的Xaa是Gly、Ala或Gln；
第47位处的Xaa是Phe、Cys、Val或Tyr；
第48位处的Xaa是Val、Ile或Leu；
第49位处的Xaa是Leu、Cys、Phe、Met、Arg或Tyr；
第50位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Ile、Met、Pro、Gln、Thr或Val；
第51位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Met或Val；
第52位处的Xaa是Lys、Cys、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr；
第53位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、
Thr、Val或Tyr；
第54位处的Xaa是Asn、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、Lys、Met、Gln、Arg、Ser或Trp；
第56位处的Xaa是Ala、Gly、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser或Thr；
第57位处的Xaa是Gln、Glu、Leu、Met、Ser或Thr；
第58位处的Xaa是His、Ala、Asp、Phe、Leu、Met、Asn、Arg、Trp或Tyr；
第60位处的Xaa是Tyr、Glu或Phe；
第63位处的Xaa是Gln、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Thr、Val或Tyr；
第64位处的Xaa是Ala、Phe、Gly、His、Arg、Ser或Tyr；
第65位处的Xaa是Ser、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Thr或Val；
第66位处的Xaa是Ser、Ala或Gly；
第67位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、
Val、Trp或Tyr；
第68位处的Xaa是Ile、Asp、Leu或Val；
第69位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或
Tyr；
第70位处的Xaa是Val、Cys或Ile；
第71位处的Xaa是Asp、Ala、Cys、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Val或Tyr；
第72位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或
Trp；
第73位处的Xaa是Asn、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Ser、Thr、Val或Tyr；
第74位处的Xaa是Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或
Tyr；
第75位处的Xaa是Val、Cys、Ile或Leu；
第76位处的Xaa是Lys、Ala、Cys、Phe、His、Ile、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr；
第77位处的Xaa是Asp、Tyr；
第78位处的Xaa是Gln、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、
Val或Tyr；
第79位处的Xaa是Gly、Arg、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、
Thr、Trp或Tyr；
第80位处的Xaa是Arg、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Ser、Thr、Val或Tyr；
第81位处的Xaa是Leu、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr或Val；
第82位处的Xaa是Ile、Ala、Leu、Met、Arg或Val；
第83位处的Xaa是Glu、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、
Thr、Val或Tyr；
第84位处的Xaa是Pro、Ala、Cys、Glu、Ile、Ser、Val、Trp或Tyr；
第85位处的Xaa是Leu、Cys、Gly或Val；并且
第86位处的Xaa是Ser、Ala、Ile、Thr或Val。
15.根据权利要求10、11和13中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的PIP-72
多肽包含下式所示的氨基酸序列：
其中
第2位处的Xaa是Gly、Lys或Ala；
第3位处的Xaa是Ile或Leu；
第4位处的Xaa是Thr或Ser；
第5位处的Xaa是Val或Ile；
第6位处的Xaa是Thr或Lys；
第8位处的Xaa是Asn、Lys、Gly或Ser；
第9位处的Xaa是Ser或Ala；
第11位处的Xaa是Asn、Lys、His或Thr；
第12位处的Xaa是Pro、Thr、Lys或Ser；
第13位处的Xaa是Ile或Val；
第14位处的Xaa是Glu或Asp；
第15位处的Xaa是Val、Ala或Ile；
第16位处的Xaa是Ala或Ser；
第17位处的Xaa是Ile或Val；
第18位处的Xaa是Asn或Ser；
第19位处的Xaa是His、Lys、Arg、Gln或Ala；
第21位处的Xaa是Gly或Arg；
第22位处的Xaa是Ser、Lys、Asn、Asp或Thr；
第25位处的Xaa是Asp或Asn；
第26位处的Xaa是Thr或Asp；
第27位处的Xaa是Ser、Thr、Asn或Lys；
第28位处的Xaa是Phe、Tyr或Pro；
第29位处的Xaa是Phe或Tyr；
第30位处的Xaa是Ser、Gly或Lys；
第31位处的Xaa是Val、Ile或Met；
第32位处的Xaa是Gly、Ala或Asp；
第33位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Pro；
第35位处的Xaa是Lys、Glu或Ser；
第36位处的Xaa是Gln、Asn或Ser；
第37位处的Xaa是Glu或Asp；
第38位处的Xaa是Thr或Ser；
第42位处的Xaa是Ser或Asn；
第44位处的Xaa是Ser、Asp、Ala或Leu；
第47位处的Xaa是Phe或Tyr；
第48位处的Xaa是Leu或Met；
第49位处的Xaa是Leu或Met；
第50位处的Xaa是Ser、Ala或Tyr；
第51位处的Xaa是Leu或Val；
第52位处的Xaa是Lys或Gln；
第53位处的Xaa是Lys、Arg、Met或Leu；
第54位处的Xaa是Asn、Lys或Gly；
第55位处的Xaa是Gly或Ser；
第56位处的Xaa是Ala、Thr、Gln或Ser；
第57位处的Xaa是Gln、Val或Ala；
第58位处的Xaa是His、Ala、Lys、Tyr或Thr；
第59位处的Xaa是Pro或Thr；
第62位处的Xaa是Val或Ile；
第63位处的Xaa是Gln、Ser或Leu；
第64位处的Xaa是Ala、Gln或Ser；
第65位处的Xaa是Ser或Thr；
第67位处的Xaa是Lys、Gln、Arg或Asn；
第69位处的Xaa是Glu、Lys或Val；
第70位处的Xaa是Val或Ile；
第71位处的Xaa是Asp、Glu或Tyr；
第72位处的Xaa是Asn、His、Ser或Asp；
第73位处的Xaa是Asn、Ser或Asp；
第74位处的Xaa是Ala、Thr、Met、Ile或Lys；
第76位处的Xaa是Lys或Thr；
第78位处的Xaa是Gln、His或Ser；
第80位处的Xaa是Arg、Glu或Gln；
第81位处的Xaa是Leu、Pro、Ala或Thr；
第82位处的Xaa是Ile或Leu；
第83位处的Xaa是Glu、His、Asn、Gln或Leu；
第85位处的Xaa是Leu、Val或Ala；并且
第86位处的Xaa是Ser、Ala、Tyr或Asn。
16.根据权利要求10、11和13中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的PIP-72
多肽包含下式所示的氨基酸序列：
其中
第2位处的Xaa是Gly、Lys、Ala或Arg；
第3位处的Xaa是Ile、Leu或Val；
第4位处的Xaa是Thr或Ser；
第5位处的Xaa是Val、Ile或Leu；
第6位处的Xaa是Thr、Lys、Ser或Arg；
第8位处的Xaa是Asn、Lys、Gly、Ser、Gln、Arg、Thr或Ala；
第9位处的Xaa是Ser、Ala或Thr；
第11位处的Xaa是Asn、Lys、Thr、Gln、Arg、His或Ser；
第12位处的Xaa是Pro、Thr、Lys、Ser或Arg；
第13位处的Xaa是Ile、Val或Leu；
第14位处的Xaa是Glu或Asp；
第15位处的Xaa是Val、Ala、Ile或Leu；
第16位处的Xaa是Ala或Ser；
第17位处的Xaa是Ile、Val或Leu；
第18位处的Xaa是Asn、Ser、Gln或Thr；
第19位处的Xaa是His、Lys、Ala、Gln、Asn或Arg；
第21位处的Xaa是Gly、Arg或Lys；
第22位处的Xaa是Ser、Lys、Asn、Thr、Arg、Asp、Glu或Gln；
第25位处的Xaa是Asp、Asn、Glu或Gln；
第26位处的Xaa是Thr、Asp、Ser或Glu；
第27位处的Xaa是Ser、Thr、Lys、Asn、Gln或Arg；
第28位处的Xaa是Phe、Tyr、Pro或Trp；
第29位处的Xaa是Phe、Tyr或Trp；
第30位处的Xaa是Ser、Gly、Lys、Thr或Arg；
第31位处的Xaa是Val、Ile、Met或Leu；
第32位处的Xaa是Gly、Ala、Asp...

【专利技术属性】
技术研发人员：S迪伊恩，J恩格里斯，刘璐，A昂，J奥拉，B罗森，U舍伦伯格，I尤德兰斯基，卫俊智，谢卫平，朱根海，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US