本发明专利技术公布了日本沼虾MnRXR基因、其扩增引物组及扩增方法。利用本发明专利技术提供的引物组从日本沼虾肝胰腺组织中克隆到了MnRXR基因全长cDNA序列，该基因包括两种可变剪切体MnRXR-L和MnRXR-S。本发明专利技术对日本沼虾MnRXR基因功能尤其在蜕皮周期中的重要作用的研究奠定重要基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及日本沼虾MnRXR基因、其扩增弓丨物组及扩增方法。
技术介绍
维甲酸X受体(RXR,retinoid x receptor)是动物核受体(nuclear receptor)超家族最保守的成员之一，在脊椎动物和无脊椎动物中都有发现。RXR具有重要的生物学功能，在脊椎动物发育、代谢、细胞分化、凋亡等多个生物学过程都发挥重要作用，而在无脊椎动物中主要与脱皮激素受体(ecdysteroid receptor, ECR)作用形成异源二聚体,脱皮激素进入细胞内与之结合形成有功能的形式从而调控下游一系列蜕皮相关的基因的表达，最终触发动物的蜕皮反应。RXR-ECR异源二聚体是甲壳类等蜕皮分子信号途径必不可少的关键节点。 日本沼奸(Macrobrachium nipponense),俗名青奸，河奸，隶属甲壳纲(Crustacean)、十足目(Decapoda)、长臂虫下科(Palaemonidae)、沼虫下属(Macrobrachium),在中国各地都有分布,是我国重要的淡水养殖种类。与高等动物的连续生长不一样，甲壳类动物的生长是跳跃式的，每蜕皮一次体重增长近一倍，蜕皮对甲壳类动物生长极为重要。探求虾蟹蜕皮的分子机制，掌握其中的主要变化，对经济虾蟹类养殖获得更高的产量具有重要的指导意义。目前，有几种奸蟹类RXR基因已被克隆，包括-Marsupenaeus Japonicas^Fenneropenaeus chinensis^ Crangon crangon 等，而日本沼奸的 RXR 基因(这里命名为MnRXR')还未见报道。我们利用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)克隆技术克隆了日本沼虾基因全长cDNA，并发现基因有两种可变剪切体ifo/MTP-Z和ifo/MTP-&这些结果对了解日本沼虾的蜕皮过程具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供日本沼虾ifo/MTP基因、其扩增引物组及扩增方法。本专利技术所述的日本沼虾基因，有两种可变剪切体ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示。本专利技术还提供了用于扩增日本沼虾基因，包括两种可变剪切体ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S的引物组，M7TMTP-Z和共用一组扩增引物，其由如下引物组成 3'正向外引物3aMnRXR-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; 3'正向内引物3aMnRXR-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; 5'反向外引物5aMnRXR-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示; 5'反向外引物5aMnRXR-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。本专利技术还提供了一种扩增日本沼虾基因，包括两种可变剪切体ifo/MTP-Z和MnRXR-S的方法，包括如下步骤 步骤1:获得日本沼虾肝胰腺组织的总RNA ；步骤2 :从日本沼奸高通量测序数据库(NCBI accession number SRA051767. 2)中筛选到基因片段，以此作为中间序列； 步骤3 :以步骤I所得总RNA为模板，以所述的引物组为引物，通过PCR扩增获得日本沼虾MnRXR基因的3'和5'端片段； 步骤4 :将所述基因中间序列、所述基因的3'和5'端片段拼接，即得。作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。对所得序列用NCBI网站进行blastx在线分析,与JfoTPiTP序列一致性(Sequencesproducing significant alignments )最高的前100个序列都是RXR或RXR在昆虫中的同源蛋白超气门蛋白(ultrspiracle, USP),其中前12个序列分别是七种不同的虫下蟹类Crangon crangon、Uca pugila tor^Marsupenaeus japonicus、Fenneropenaeus chinensis.、Carcinus maenas.、Homarus americanus 取 Gecarcinus lateralis 白勺 RXR (包f舌不同白勺异型体或可变剪切体)，显著性检验达到极大(e〈2xl0_18°)，可以确定所得序列为日本沼虾RXR 基因。日本沼虾基因推测的氨基酸序列具有典型的RXR核受体序列特征，包括N端DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)，主要有C2C2锌指结构组成，C端配体结合结构域(ligand binding domain, LBD)。使用Clustalx1. 81将日本沼虾MnRXR基因，包括两种可变剪切体MnRXR-L和ifo/MTP-S所编码的氨基酸序列与已公布的部分虾蟹类RXR氨基酸序列进行比对，使用MEGA3.1软件计算遗传距离，结果显和ifo/PZ/P-5·与一种褐奸(Oaflgo/ crangon)相似度最高(89. 1%)。通过对日本沼虾MnRXR基因，包括两种可变剪切体ifo/MTP-Z和MnRXR-S所编码的氨基酸序列与其他物种RXR氨基酸序列利用Clustalx1. 81软件进行序列比对分析和使用MEGA3.1软件构建NJ系统发育树(如图1)，由系统发育树可见，甲壳类RXR聚类在一个大的分支上。本专利技术以日本沼虾肝胰腺组织为材料，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(nested-PCR)、3,端cDNA快速扩增(3' RACE)以及Y端cDNA快速扩增(5' RACE)的方法，对日本沼虾MnRXR基因进行了研究，首次从日本沼虾肝胰腺组织中克隆到了 MnRXR基因全长cDNA序列，包括两种可变剪切体MnRXR-L和MnRXR-S，并对其所编码的MnRXR的序列特征、同源性、进化地位及表达谱进行了分析，确定其为日本沼虾RXR基因，这些结果对了解日本沼虾的蜕皮过程具有重要意义。附图说明图1不同种类的动物RXR核受体的NJ系统进化树； 图2基因两种可变剪切体ifo/MTP-Z和ifo/MTP-S的PCR验证； 图3 Μη/PXR基因在蜕皮周期受诱导表达，A :肝脏组织；B :肌肉组织； 图4 基因两种可变剪切体ifo/MTP-Z和在蜕皮周期过程中不同的表达情况，A :肝脏组织；B :肌肉组织。具体实施例方式下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。本专利技术中日本沼虾由无锡太湖渔民提供，试剂均可由市场购得，RNA纯化等试剂购自美国Promega公司等，3' RACE和5' RACE试剂盒购自宝生物(大连)有限公司(Takara)。总RNA提取取IOOmg日本沼虾肝胰腺组织在研钵中加液氮研磨，用Trizol法提取总RNA, Trizol试剂采用Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。日本沼虾基因全长cDNA序列的克隆，包括两个可变剪切体ifo/MTP-Z和MnRXR-S 以公开的甲壳动物Daphnia magna的RXR-1ike蛋白序列(GenBank accessionnumber :ABF74729.1)为比对模板,blastx 日本沼奸Roche 454测序数据库(NCBI SequenceRead Archive accessi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种日本沼虾MnRXR基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈怀舜，周鑫，柏爱旭，任秀芳，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：
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