本发明专利技术公开了一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成：试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水制成；试剂B：蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；试剂C：乙醇水溶液；试剂D：用含MgCl2的PCR反应缓冲液、Taq?DNA聚合酶、灭菌双蒸水混合制成；试剂E：引物P1，引物P2，脱氧核糖核苷酸混合制成；试剂F:荧光探针预混溶液；试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒；灭菌双蒸水；DNA吸附柱。本发明专利技术的试剂盒检测灵敏度高，可用于养殖对虾白斑综合症病毒早期感染及跟踪监测，还能用于与该病毒增殖相关的基础科学研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种对虾白斑综合症病毒的检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
自上世纪九十年代以来，对虾白斑综合症病毒引起世界范围内养殖对虾的急性、致死性传染病，造成对虾养殖业的巨大经济损失。对虾白斑综合症病毒是一种具有囊膜的双链DNA病毒。除了对虾，该病毒也侵染海、淡水中的甲壳动物如蟹和小龙虾等。目前，该病毒引发的对虾疾病已经成为一个世界性的流行性疾病，它不仅是对虾养殖业的一个巨大的威胁，同时也危害到了整个海洋生态环境。对于甲壳动物病毒性疾病，目前还没有有效的治疗方法，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此，建立快速灵敏实用的对虾白斑综合症病毒检测技术，不仅能及时预报预测该病毒所致病害的发生，同时也是今后加强科学养殖管理，建立苗种检验检疫体系所必须的。 对虾病毒病检测技术主要包括现场目视观察法、光学显微镜检查法、电子显微镜检查法、免疫荧光检查法等。但这些技术各有其局限性。现场目视观察和光学显微镜检查法不太适用于早期检测，通常在病毒严重感染，产生明显的不可逆转的组织病变时才可得到确证；电子显微镜检查耗时长，费用高并需要特殊的实验器材；免疫荧光检测法操作繁琐，灵敏度低。PCR技术检测灵敏度高，特异性强，检测周期短，操作相对简便，目前已广泛应用于对虾白斑综合症病毒的检测。但是这些方法仅是用于病毒的定性检测，不能定量。由于目前还没有对对虾病毒敏感的细胞系，因此定量检测对虾病毒一直比较困难。最近发展的实时荧光定量PCR技术提供了病毒定量检测的新途径。该技术巧妙地利用了 PCR技术的高效扩增，探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，克服了常规PCR不能定量检测等一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性。Dhar报道了利用SYBR Green定量检测对虾白斑综合症病毒。由于该染料能与所有的DNA双链相结合，对模板没有选择性，所以特异性差，定量相对不准确。王忠发等初步建立了 Taqman实时荧光定量PCR方法检测对虾白斑综合症病毒，但是没有制备标准曲线，因此尚未达到真正的定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术的第二个目的是提供一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法。本专利技术的技术方案概述如下一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成试剂A :将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有I. 5-3g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为I. 3-1. 5M，乙二胺四乙酸的浓度为15-25mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为15_25禮，调节pH =7. 5制成试剂A ；试剂B :浓度为20_30mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水； 试剂C 体积百分浓度为70-80%的乙醇水溶液；试剂D :按比例用10倍含MgCl2的PCR反应缓冲液2. 5 μ l.Taq DNA聚合酶I. 5U、灭菌双蒸水17. 7 μ I混合制成； 试剂E :按比例用 0.5 μ L，10 μ M 的用 SEQ ID NO. I 所示的引物 Ρ1，O. 5 μ 1，10 μ M的用SEQID NO. 2所示的引物Ρ2，I. 5 μ 1，IOmM脱氧核糖核苷酸混合制成；试剂F: I. O μ 1，10 μ M的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’ -TET-SEQID NO. 3-TAMRA-3’ 表示；试剂G :对虾白斑综合症病毒阳性质粒；灭菌双蒸水；DNA 吸附柱。一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤步骤一模板的制备(I)取待测对虾的鳃丝组织20_50mg，加入500-700 μ I试剂Α，用剪刀充分剪碎；(2)加入 15-25 μ I 试剂 B, 55°C水浴 2-8 小时；(3)转入到一个 DNA 吸附柱中，12000rpm Imin ；(4)向吸附柱中加入 500-700 μ I 试剂 C，12000rpm Imin ；(5)再向吸附柱中加入 500-700 μ I 试剂 C，12000rpm Imin ；(6)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附柱中加入50 μ I灭菌双蒸水，12000rpm 2min,收集DNA溶液为待测模板；步骤二 突光PCR扩增(7)将试剂D 20. 5 μ I,试剂E 2. 5 μ I,试剂F I. O μ I混合，加入I μ I待测模板；(8)再将试剂D 164 μ I,试剂E 20 μ I,试剂F 8. O μ I混合，平均分为8份；(9)将试剂G用灭菌双蒸水做8个十倍系列梯度稀释，分别加入到步骤(8)获得的每个混合液中，每个稀释度分别取I μ I作为阳性质控模板；(10)在荧光定量PCR仪上扩增；反应条件为95°C预处理30s，95°C 5s，60°C 30s，40个循环，60°C时测定荧光值；步骤三数据处理(11)用试剂G不同稀释度获得的Ct值与相应的拷贝数的对数做标准曲线，获得用X代表的Ct值，与用y代表的病毒拷贝数对数的二元一次方程，根据此二元一次方程计算出待测样品的病毒拷贝数。所述对虾为南美白对虾，中国对虾，斑节对虾或日本对虾。优选的是，对虾白斑综合症病毒阳性质粒是用下述方法制成的PCR扩增对虾白斑综合症病毒的一段保守区序列，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到PMD-18T载体上并转化到T0P10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中重新培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，分光光度计测定质粒浓度，计算出质粒的拷贝数，作为试剂盒的阳性质控。本专利技术的优点利用对虾白斑综合症病毒的基因组保守区序列设计一对引物及荧光探针，优化荧光定量PCR反应条件和反应体系，建立起对虾白斑综合症病毒的荧光定量PCR检测方法，在此基础上装配出简便、灵敏、特异的对虾白斑综合症病毒荧光定量检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，可用于对养殖南美白对虾、中国对虾、斑节对虾等的对虾白斑综合症病毒早期感染及跟踪监测，还能用于与该病毒增殖相关的基础科学研究。具有很高的科学及实用价值。附图说明图I荧光定量PCR标准曲线。 图2对虾白斑综合症病毒不同浓度标准品的荧光PCR扩增动力学曲线(1-7:6. 2X IO7 6. 2X101 拷贝)具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例I一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成试剂A :将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有2g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为I. 4M，乙二胺四乙酸的浓度为20mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为20mM，调节pH = 7. 5制成试剂A ；试剂B :浓度为25mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；试剂C 体积百分浓度为75%的乙醇水溶液；试剂D :按比例用10倍含MgCl2的PCR反应缓冲液2. 5 μ l.Taq DNA聚合酶I. 5U、灭菌双蒸水17. 7 μ I混合制成；试剂E :按比例用 0.5 μ L，10 μ M 的用 SEQ ID NO. I 所示的引物 Ρ1，O. 5 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是由下述试剂组成：试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷?盐酸加水100ml，使试剂A中含有1.5?3g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为1.3?1.5M，乙二胺四乙酸的浓度为15?25mM，羟基甲基氨基甲烷?盐酸的浓度为15?25mM,调节pH＝7.5制成试剂A；试剂B：浓度为20?30mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；试剂C：体积百分浓度为70?80%的乙醇水溶液；试剂D：按比例用10倍含MgCl2的PCR反应缓冲液2.5μl、Taq?DNA聚合酶1.5U、灭菌双蒸水17.7μl混合制成；试剂E：按比例用0.5μL，10μM的用SEQ?ID?NO.1所示的引物P1，0.5μl，10μM的用SEQID?NO.2所示的引物P2，1.5μl，10mM脱氧核糖核苷酸混合制成；试剂F:1.0μl，10μM的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’?TET?SEQID?NO.3?TAMRA?3’表示；试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒；灭菌双蒸水；DNA吸附柱。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙金生，薛淑霞，董学旺，
申请(专利权)人：天津市水生动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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