本发明专利技术涉及一种用于检测对虾病毒的引物和液相芯片及其用途。其中上游引物具有R1-R2-R3所表示的序列，R1与液相芯片的微球连接序列反向互补，R3与待检测序列互补，R2为间臂，优选（CH2）18间臂；下游引物标记生物素。具体涉及用于检测对虾一至五种病毒（WSSV、TSV、YHV、IHHNV和/或IMNV）的至少一对液相芯片引物，还涉及包含所述引物序列的液相芯片、试剂盒，及其用途和检测方法。采用本发明专利技术方法，只进行一次试验就能同时快速检测对虾一至多种病毒，不互相干扰。操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高，样品适用范围广，试剂中均无感染性的和生物安全隐患的成分，使用安全。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别是涉及检测芯片领域，尤其涉及一种用于检测对虾病毒的引物、液相芯片及其用途。
技术介绍
随着水产养殖规模的扩大，特别是在集约化养殖的情况下，养殖水体、环境的恶化，养殖密度的增大，水体富营养化和饲养管理不当等，再加上对虾属无脊椎动物，缺乏特异性免疫系统等，导致近年来养殖病害的扩大和蔓延，甚至发展到愈演愈烈的趋势。对虾病毒尚不能进行体外培养，对虾病毒病不仅无特效药可治，而且造成大规模毁灭性的死亡。更令人担忧的是各种病害防治还只是停留在化学治疗水平，为防止继发和混合感染，药物滥用已造成病原菌广泛耐药，同时水产品的药物残留已成社会关注的问题，甚至导致对虾出口受阻，影响国际名声，危害消费者的健康，严重妨碍对虾养殖业的健康发展。为此，建立快速、灵敏、特异的对虾病毒诊断技术不仅能快速确诊病因，及时检测病害发生及发展趋势，而且也是今后加强科学养殖管理，建立进出口对虾种苗及其产品的检验检疫体系，实现现代化养殖所必需的。对虾病害检测技术的研究在国内起步相对较晚，但近年来随着分子生物学技术的应用，有力推动了对虾病原检测的发展。国内在对虾病毒的检测方面分别建立了几种主要病原的免疫学技术、核酸探针及PCR检测技术的研究。但由于国内养殖状况主要是个体、分散和粗放等形式，对致病病原体的种苗检测、早期监控、定期检测等病害检测体系基本上没有建立，往往是发病后才引起关注，这与国外大型养殖公司相比，还存在着相当大的差距。基因芯片是分子生物学和微细加工技术相结合的产物，目前基因芯片技术广泛应用于基因图绘制、表达谱分析、多态性研究、序列测定，同时也在疾病研究和病毒感染诊断等方面得到了广泛的应用。鉴于我国对虾病毒病发生流行时往往是几种病毒病混合、交叉或继发感染，仅凭疾病的流行特征、发病症状及组织学病理等方法是很难对其进行准确的诊断，更何况有些表面健康的虾，由于受到水质环境、饵料和病毒本身特性的影响都或多或少的携带有一种或几种病毒。目前人们最常采用的PCR技术以其高灵敏度虽然为病毒感染的诊断提供了一种有力的工具，但同时非特异性产物的增多也容易导致临床诊断错误，故必须将PCR产物进行测序，否则检查结果不可信。特别是需要大批量的同时检测几种病毒病时，采用单一 PCR方法逐一检测时，则比较费时、费力和费钱，难于推广。白斑综合症病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)和传染性肌肉坏死病病毒(IMNV)是感染对虾最重要的病毒之一。因此，目前急需一种成本低，方法简单，准确率高的检测五种病毒的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便快捷、准确率高、特异性好、灵敏度高，高通量的检测对虾病毒的方法。为实现上述目的，本专利技术提供检测对虾一至五种病毒液相芯片检测引物。其上游引物具有R1-R2-R3所表示的序列，，其中Rl与液相芯片的微球连接序列反向互补，R3与待检测序列互补，R2为多聚dT，或寡聚四聚乙二醇，或(CH2)n间臂，η > 3 ;优选R2为(CH2) η间臂，η为12或18 ;更优选R2为(CH2) η间臂，η为18 ;下游引物标记生物素。 其引物序列为以下至少一对检测WSSV的引物上游引物中Rl为SEQ ID NO: I,R3为SEQ ID Ν0:2，下游引物为SEQ ID Ν0:3，并5’端标记生物素；检测TSV的引物上游引物中Rl为SEQ ID N0:4，R3为SEQ ID N0:5，下游引物为SEQ ID N0:6，并5’端标记生物素；检测YHV的引物上游引物中Rl为SEQ ID N0:7, R3为SEQ ID N0:8，下游引物为SEQID N0:9，并5，端标记生物素；检测IHHNV的引物上游引物中Rl为SEQ ID NO: 10, R3为SEQ ID N0:11，下游引物为SEQ ID NO: 12，并5’端标记生物素；检测頂NV的引物上游引物中Rl为SEQ IDN0:13，R3为SEQ ID NO: 14，下游引物为SEQ ID NO: 15，并5’端标记生物素。本专利技术还涉及一种用于检测对虾一至五种病毒的液相芯片，其特征是，包括I)所述引物；2)偶联一定核苷酸序列的微球，所述序列选自SEQ ID NO: 16_20，并能相应的与I)中引物序列互补配对。本专利技术还涉及一种用于检测对虾一至五种病毒的试剂盒，含有权利要求2的引物和权利要求3的液相芯片。本专利技术还保护所述引物，所述液相芯片，所述试剂盒用于检测对虾一至五种病毒的用途。本专利技术还保护所述引物，所述液相芯片，所述试剂盒用于检测对虾一至五种病毒的方法，其步骤为样品DNA或RNA提取；PCR 扩增；与微球杂交；仪器分析。所述样品DNA或RNA提取中，需要对DNA和RNA进行260nm和280nm的紫外光吸收率的测定，0D260值在O. 05 I的区间内，且0D260/0D280比值在I. 5 2. O之间。所述PCR扩增中，采用权利要求I所述的引物进行扩增；PCR的扩增体系如下2XTaqManFast Universal PCR Master Mix 25 μ L ;上下游引物分别浓度为 O. 3 μ mol/L I. O μ mol/L ;从对奸中提取病毒RNA并合成的cDNA模板5 μ L或病毒DNA5 μ L ;补水至50 μ L ;反应条件为95°C变性IOmin ；95°C 45s，60°C退火45s，72°C延伸45s，循环40次；72 0C 3min。所述与微球杂交为，取I μ L权利要求2的微球，加入22. 5 μ L的I. I X杂交缓冲液，混匀；加入2. 5μ LPCR产物，95°C变性2min，然后42°C孵育30min ;加入100 μ L的用IX杂交缓冲液稀释 100 倍的 streptavidin-R-phycoerythrin, 37°C孵育 20min 所述 1.1X 的杂交缓冲液为 O. 11 MTri s -HC I ,0. 22 MN a C I 和 O. 088% TritonX-100 ;所述 IX 杂交缓冲液为 O. IMTri s-HC 1,0. 2 M N a C I 和 O. 08% T r it ο η X — IOO0所述仪器分析为在LumineXTM200仪器上读取荧光中位数MF I值，根据读数进行结果判定；具体的，所述结果判定为当样品的MFI值与空白样品的MFI值的比值> 3时结果判为阳性，如果其比值< 2时判为阴性，如果2 <比值< 3时结果判为可疑。本专利技术选择GENBANK中WSSV的囊膜蛋白基因28、TSV的衣壳蛋白基因VP2、YHV衣壳蛋白基因GPl 16、IHHNV的衣壳蛋白基因和MNV的衣壳蛋白基因。根据上述五种对虾病毒的基因进行序列同源性比较，根据其保守区域，通过primer 5. O软件设计，并经过大量的反应条件优选，对比试验和验证试验才获得的用于鉴别诊断的特异性引物。所形成的引物组合包含的引物碱基数为18 24个，引物的熔解温度Tm值为58°C 65°C，引物GC%为40% 60%。同时进行筛选，保留不能形成引物二聚体的引物，所获得的这对引物其扩增的目标片段长度为IOObp 150本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种液相芯片检测引物，其上游引物具有R1？R2？R3所表示的序列，，其中R1与液相芯片的微球连接序列反向互补，R3与待检测序列互补，R2为多聚dT，或寡聚四聚乙二醇，或（CH2）n间臂，n≥3；优选R2为（CH2）n间臂，n为12或18；更优选R2为（CH2）n间臂，n为18；下游引物标记生物素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢明星，彭小莉，刘棠，王群力，陈伟玲，王伟，陈双雅，刘荭，郑晓聪，王景明，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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