快速检测和鉴定生物物体的方法技术

检测和鉴定未知生物体，包括细菌、病毒等的方法，采用了能与生物体的核酸的保守序列区域杂交的并含有能独特分辨法生物体的可变序列区域的引物。结果是一种“碱基组成签名”(BCS)，然后与碱基组成签名数据库匹配，由此鉴定该生物体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及快速检测和鉴定环境、临床或其它样品中的生物体的方法。该方法提供了检测和特征分析任何生物体，包括细菌和病毒的独特碱基组合签名(BCS)。这种独特的BCS可用于快速鉴定该生物体。
技术介绍
快速和明确的微生物鉴定对各种工业、医学、环境、质量和研究原因是需要的。传统上，微生物学实验室的功能是通过直接检查和培养样品来鉴定传染性疾病的病原体。自从1980年代中期以来研究者们反复证明了分子生物学技术在实践上的用途，许多这些技术形成了临床诊断试验的基础。这些技术中的一些包括核酸杂交分析、限制性酶分析、遗传序列分析和核酸的分离及纯化(参见，如J. Sambrook, E. F. Fritsch和T. Maniatis,分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。这些方法一般费时且冗长。另一选择是聚合酶链式反应(PCR)，或其它扩增方法，根据所用侧翼引物扩增特异性靶DNA序列。最后，检测和数据分析可将杂交转换成分析结果。其它检测生物体的技术包括高分辨率质谱(MS)、低分辨率MS、荧光、放射性碘化、DNA芯片和抗体技术。这些技术中没有一个是完全令人满意的。质谱提供了被分析分子的详细信息，包括很高的质量准确性。它也是一种可容易地自动化的方法。然而，高分辨率MS单独不能用来对未知的或生物工程改造的生物体进行分析，或运用于存在高背景水平生物体(“混乱的”背景)的环境中。低分辨率MS不能检测某些已知的生物体，如果它们的光谱线足够弱或足够接近样品中其它活生物体的光谱线。具有特异性探针的DNA芯片只能够测定具体的预计的生物体的存在与否。因为有几十万种良性细菌，一些细菌在序列上十分类似于有威肋的细菌，即使有10，000个探针的芯片陈列仍缺乏检测具体生物体所需的宽度。抗体面对的多样性限制比陈列更严峻。如果抗体设计是针对高度保守的靶子以提高多样性，假报警问题就会是主要问题，还是因为危险生物体十分类似于良性生物体。抗体只能检测相对不混乱环境中的已知生物体。一些研究中组报道了用高分辨率电喷射离子化-傅立叶变换-离子回旋共振质谱法(ESI-FT-ICR MS)检测PCR产物。准确测定确切的质量与至少一种核苷的数量的知识相结合,可计算出大约100个碱基对的PCR双链体产物的总碱基组成。(Aaserud等.，J. Am. Soc. Mass Spec. 7 :1266-1269,1966 ;Muddiman 等·，Anal. Chem. 69 :1543-1549,1997 ；Wunschel 等.，Anal. Chem. 70 :1203-1207,1998 ；Muddiman 等.，Rev.Anal. Chem. 17 :1-68,1998)。电喷射离子化-傅立叶变换-离子回旋共振(ESI-FT-ICr)MS可通过平均分子质量来确定500喊基对双链体，PCR产物的质量(Hurst等.，Rapid Commun. Mass. Spec. 10 377-382,1996)。已报道了采用基质-辅助的激光解吸离子化飞行时间(MALDI-T0F)质谱来特征鉴定 PCR 产物。(Muddiman 等.,Rapid Commun. Mass. Spec. 13 :1201-1204,1999)。然而，用MALDI只能观察75个核苷以上的DNA的降解限制了此方法的应用。 美国专利5，849，492描述了挽回系统发育信息DNA序列的方法，包括搜索两个高度保守片断包围的基因组DNA的高度趋异区段，设计了用PCR扩增此高度趋异区域的通用引物，用此通用引物经PCR技术扩增该基因组DNA，然后测是比基因序列以确定该生物体的身份。美国专利5，965，363公开了用质谱技术分析扩增的靶核酸来筛检核酸多态性的方法，和提高这些方法的质量分辨率及质量准确性的方法。WO 99/14375描述了通过质谱分析预选的DNA串联核苷酸重复等位基因所用的方法、PCR引物和试剂盒。WO 98/12355公开了通过质谱分析测定靶核酸的质量的方法，通过切割靶核酸以减少其长度，产生靶单链并用MS测定单链变短的靶子的质量。还公开了制备用于MS分析的双链靶核酸的方法，包括扩增靶核酸，使一条链结合于固相载体，释放第二条链，并随后释放第一条链，接着用MS分析。也提供了制备靶核酸的试剂盒。PCT WO 97/33000公开了检测靶核酸中突变的方法，通过使靶子非随机断裂成一组单链非随机长度的片断，并用MS测定它们的质量。美国专利5，605，798报道了快速和高度准确的以质谱仪为基础的方法，检测生物样品中特定核酸的存在用于诊断目的。WO 98/21066描述了通过质谱测定特定靶核酸序列的方法。公开了用PCR扩增和质谱检测来检测生物样品中靶核酸存在的方法，也报道了通过用含有限制性酶切位点和标记的引物扩增样品中的靶子，延伸和切割扩增的核酸，并检测延伸产物的存在来检测靶核酸的方法，其中存在不同于野生型质量的DNA片断表明有突变。通过质谱方法测定核酸序列的方法也有报道。WO 97/3704UW0 99/31278和美国专利5，547，835描述了用质谱测定核酸序列的方法。美国专利5，622，824,5, 872，003和5，691，141描述了用于外切核酸酶_介导的质谱测序的方法、系统和试剂盒。因此，需要一种特异和快速的生物体检测和鉴定的方法，其中不需要给核酸测序。本专利技术符合此需求。
技术实现思路
本专利技术的一个实施方案是一种鉴定未知生物体的方法，该方法包括(a)使该生物体的核酸接触至少一对寡核苷酸引物，此引物能与该核酸序列杂交并侧接有一可变的核酸序列；(b)扩增此可变的核酸序列产生扩增产物；(c)测定此扩增产物的分子量；(d)将此分子量与在多种已知生物体上进行步骤(a)-(c)所获得的一种或多种扩增产物的分子量相比较，其中一种匹配可鉴定该未知的生物体。在此优选实施方案的一个方面，能与至少一对寡核苷酸引物杂交的序列高度保守。优选扩增步骤包括聚合酶链式反应。或者，扩增步骤包括连接酶链式反应或链置换扩增。在此优选实施方案的一个方面，生物体是细菌、病毒、细胞或孢子。有利的是此核酸是核糖体RNA。在另一方面，此核酸编码RNA酶P或RNA-依赖的RNA聚合酶。优选扩增产物在分子量测定前离子化。该方法还可包括在使该核酸接触至少一对寡核苷酸引物前，从生物体中分离得到核酸的步骤。该方法还可包括使用一对不同的寡核苷酸引物进行步骤(a)-(d)的步骤，并将结果与在步骤d)的不同的多种已知生物体上进行步骤(a)-(c)获得的一种或多种扩增产物的分子量相比较。优选一种或多种分子量包含在分子量数据库中。在此优选实施方案的另一个方面，扩增产物通过电喷射离子化、基质-辅助的激光解吸或快速原子轰击而离子化。有利的是，分子量通过质谱测定。优选质谱是傅立叶变换离子回旋共振质谱法(FT-ICR-MS)、离子陷阱、四极、磁扇面、飞行时间(TOF)、Q-T0F或三重四极。该方法还可包括在存在具有与腺苷、胸苷、鸟苷或胞苷不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鸟苷或胞苷类似物时进行步骤(b)。在一方面，互寡核苷酸引物在引物中各个三联体位置I和2上含有碱基类似物或替换碱基，其中此碱基类似物或替换碱基能以比天然碱基更高的亲和力与其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定未知生物体的方法，其特征在于，所述方法包括：a)使所述生物体的核酸接触至少一对寡核苷酸引物，此引物能与所述核酸的序列杂交，其中所述序列侧接有该生物体的可变核酸序列；b)扩增所述可变核酸序列产生扩增产物；c)测定所述扩增产物的分子量；d)将所述分子量与在多种已知生物体上进行步骤a)？c)获得的一种或多种扩增产物的分子量相比较，其中一种匹配可鉴定所述的未知生物体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·埃克，R·H·格里菲，R·桑帕斯，S·霍夫施塔勒，J·迈克尼尔，
申请(专利权)人：IBIS生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：