本发明专利技术公开了一种检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物及其应用。本发明专利技术所提供的引物为引物组，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。实验证明，上述引物利用特异性强的钙黄绿素：氯化锰作为显色剂，通过环介导等温扩增检测对虾白斑综合征病毒速度快，灵敏度高，特异性强，对仪器要求不高，无需染色或显色，肉眼可直接判断结果，对虾苗引种和无特定病原体种虾培育以及对虾无公害健康养殖均有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测对虾白斑综合征病毒的环介导等温扩增引物及其应用。
技术介绍
对奸白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是近年来新发现的一种严重危害养殖对虾的病毒，根据国际病毒分类委员会(ICTV)第7次报告，该病毒属于线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)。该病毒宿主广泛，除了感染对奸引起对虾严重死亡外，还可以感染野生甲壳类、挠足类等其它40多种海洋环境生物。由于WSSV危害严重，成为威胁对虾养殖业的主要疾病之一，因此，1995年被国际兽疫局(0ΙΕ)、联合各粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)同时列为必报的水生动物疫病。目前，WSSV的检测诊断方法主要包括聚合酶链反应(PCR)检测技术、核酸探针技术和ELISA检测技术等。其中，PCR检测技术以其简便快捷、特异性好、敏感性高等特点被OIE推荐为该病的检测手段之一。环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)技术是2000 年Notomi等在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术。与PCR技术相比，两者最大的差异在于靶基因引物的设计上。其中，PCR只使用一对与靶基因两端序列互补的上下游引物，而LAMP则针对靶基因的6个不同区域，设计4种特异引物——内侧引物对和外侧引物对，必要时再加上环形引物对，对靶基因进行扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行扩增反应，因此其特异性和敏感性均比PCR更高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物组。本专利技术所提供的检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物组为引物组A 或引物组B ;所述引物组A由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物3 (FIP)、所述引物4 (BIP)、所述引物5 (LF)和所述引物6 (LB)的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。所述引物组A中所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物 6 的摩尔比为(1-2) (1-2) (1-3) (1-3) : (1-2) : (1-2)，如 I :1 2 2 1 1 ;所述引物组B中所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为(1-2) : (1-2) (1-3):(1-3)，如 I :1 2 :2。在本专利技术的一个实施例中，所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物5 (LF) 和所述引物6 (LB)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.6μΜ，所述引物3 (FIP) 和所述引物4 (BIP)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为1.2μΜ。所述引物组中，引物I (F3)和引物2 (Β3)组成外侧引物对；引物3 (FIP)和引物44 (BIP)组成内侧引物对；引物5 (LF)和引物6 (LB)组成环形引物对。序列I由21个核苷酸组成，序列2由19个核苷酸组成，序列3由43个核苷酸组成，序列4由40个核苷酸组成，序列5由22个核苷酸组成，序列6由20个核苷酸组成。本专利技术的又一个目的是提供一种检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂。本专利技术所提供的检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂具体可包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg2+、Mn2+、钙黄绿素和所述引物组。当所述引物组为所述引物组A时，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述链置换型DNA聚合酶、所述钙黄绿素和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为O. 3-1. 5 μ M :0. 3-1. 5 μ M : O. 6-3. 0μ M 0. 6-3. O μ M 0. 3-1. 5 μ M 0. 3-1. 5μ M 0. 4-3. 6mM l-9mM 0. 03-1. 25mM 4-40U :37· 5-125mM :0· 02-0. 2mM,具体如 O. 6 μ M :0· 6 μ M :1· 2 μ M :1· 2 μ M :0· 6 μ M : O. 6 μ M 2mM 7mM :0. 04mM 8U :0. 2mM ；当所述引物组为所述引物组B时，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述链置换型DNA聚合酶、所述钙黄绿素和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为O. 3-1. 5μΜ 0. 3-1. 5μΜ 0. 6-3. O μ M 0. 6-3. O μ M O. 4-3. 6mM l_9mM 0. 03-1. 25mM 4-40U 37. 5_125mM 0. 02-0. 2mM,具体如 0· 6 μ M : O. 6μΜ1.2μΜ1.2μΜ 2mM 7mM 0. 04mM 8U 0. 2mM。在本专利技术中，所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。在本专利技术的一个实施例中，所述试剂具体由Bst DNA聚合酶、所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液、所述甜菜碱、所述dNTPs、MnCl2、MgS04、所述钙黄绿素和所述引物组A组成。所述 Bst DNA聚合酶和所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液均为New England Biolabs公司产品。在实际使用过程中，上述试剂的各组分在环介导等温扩增反应体系中的终浓度为外侧引物F3 (序列I)和B3 (序列2)，以及环形引物LF (序列5)和LB (序列6)各 O. 6 μ mol/L ；内侧引物 FIP (序列 3)和 BIP (序列 4)各 I. 2 μ mol/L ；dNTPs 2mmol/L ； MgS047mmol/L ；MnCl2O. 04mmol/L ;甜菜喊(Betaine)O. 2mmol/L ；Bst DNA 聚合酶 8U 丐黄绿素(Calcein) 50mmol/L ;I XBstDNA 聚合酶缓冲溶液(ρΗ8· 8)。本专利技术的还一个目的是提供一种检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增试剂盒。为了提高检测结果的准确性，本专利技术所提供试剂盒除了含有所述引物组或所述扩增试剂外，还含有阳性对照质粒和/或阴性对照质粒。所述阳性对照质粒为含有序列表中序列7所示核酸分子的质粒；所述阴性对照质粒为所述阳性对照质粒去除序列表中序列7所示核酸分子后形成的质粒。在本专利技术的一个实施例中，所述阳性对照质粒具体为将序列表中序列7所示的核酸分子与PMD18-T载体相连后所得的质粒；所述阴性对照质粒具体为PMD18-T载体。所述引物组在制备所述试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有对虾白斑综合症病毒的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。5应用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒检测或辅助检测待测样品中是否含有对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤用所述引物组，或所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，庞耀珊，谢丽基，谢志勤，邓显文，刘加波，范晴，罗思思，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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