本发明专利技术公开了一种检测口蹄疫病毒的RT-HDA试剂盒及引物。所述检测口蹄疫病毒的引物，为序列表SEQ?ID?No：1和序列表SEQ?ID?No：2所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术HDA应用于口蹄疫病毒的检测中，与FMDV现有的检测方法相比：①HDA检测方法更快、更便捷，安全可靠。传统的病毒分离和血清学方法耗时较长，且存在生物安全危险性；HDA方法模仿体内天然的复制机制，安全性高，且反应快速，最多仅需2h即可完成检测；②与PCR相比不需要PCR仪，设备要求简单，仅需要一台水浴锅，从技术层面上讲更便于掌握和操作，更便于在条件不足的地区推广应用，更有利于对口蹄疫病毒的诊断和监控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测口蹄疫病毒的RT-HDA试剂盒及引物，属于检验检疫领域。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-andnouthdisease virus, FMDV)引起的急性热性高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽，患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水泡，破溃形成烂斑。人和非偶蹄动物也可感染本病，但症状较轻。由于猪、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成全球大规模流行，所以世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将该病列为A类动物传染病。在我国，口蹄疫被列为一类动物传染病。历史上口蹄疫的暴发给世界畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重的影响了社会政治、经济的稳定发展，是名副其实的“世界政治经济病”。口蹄疫在世界的 分布也很广，可在国际间相互传播形成世界范围内的大流行。至今几乎世界上所有的国家或地区历史上都曾经发生过口蹄疫。在17 19世纪，欧洲大陆曾多次发生和广泛流行本病。到20世纪80年代，大洋洲、北美洲已无口蹄疫疫情，欧洲国家的疫情也大大减少，而亚洲、非洲和南美洲各国则是口蹄疫的重疫区。近年来，口蹄疫在世界上主要流行于亚洲，其次是非洲、南美洲和欧洲。口蹄疫在我国流行历史由来已久，其特点是在一定地区一定时间接连不断发生。而且我国毗邻的很多周边国家和地区多为口蹄疫流行疫区，疫病呈周期性暴发，且反复不断。这些因素对我国造成严重威胁，发生口蹄疫大流行的可能性非常大。历年来我国政府和地方各防疫机构都非常关注口蹄疫的疫情动态，并高度重视口蹄疫的防制工作。随着加入WT0，我国从其他国家进口牛肉和猪肉等产品的批次和数量都急剧上升，所有这些都要求我们能够提高检验检疫技术水平，力促外贸工作的顺利进行并保证人畜及生产的安全。口蹄疫病毒具有型多易变的特点，目前有7个血清主型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亚洲I型。每一主型又分若干亚型，迄今为止已发现的亚型有65个，且仍可能在不同的地区出现新的变异株和新的亚型。我国口蹄疫的病毒型主要为0、A型和亚洲I型。动物感染一种血清型的病毒后，不产生对其他型的免疫力，但同型的亚型之间有部分的交叉反应。目前口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术(包括细胞培养和动物接种两种方法)、血清学检测技术(包括病毒中和试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、免疫荧光电子显微镜技术等)和分子生物学技术(包括聚合酶链式反应、核酸探针、核酸序列分析、电聚焦寡核苷酸指纹图谱法、基因芯片技术等)。实际检测中，对肉类食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性，但传统的诊断方法不能满足这一要求。常规的PCR技术虽然提高了检测的灵敏度和特异性，但也有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。近几年发展起来的实时荧光定量RT-PCR将PCR与荧光检测相结合，具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已逐渐成为病原体检测的重要方法。但是，荧光PCR仪造价不菲，仪器和试剂检测成本过高使得这一检测技术始终局限于条件比较好的实验室中，难以在基层推广应用。近年来，分子诊断技术日新月异，产生了多种新型分子扩增技术，推动着分子诊断技术向操作简单、仪器设备要求不高的方向发展。其中，依赖解旋酶恒温基因扩增技术(Helicase-Dependent Isothermal Amplification,HDA)是 2004 年 BioHelix 的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制专利技术的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。HDA技术与其他基因扩增技术比较，具有如下优势I.与PCR技术相比，HDA技术模仿自然界DNA合成方式，凭借DNA解旋酶解开双链并完成扩增，而传统PCR是通过变性-退火-延伸过程的多次循环实现。由于原理的不同，使得HDA的优点尤其突出①HDA反应在同一温度下进行，因而不需要昂贵的PCR仪，有利于在基层实验室推广应用。②由于只用一种温度扩增使得HDA反应时间明显缩短，仅需Ih左右。③HDA技术采用去除了 5’ -3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，该酶兼具耐高温性、高效扩增反应性、极好的条带均一性及高准确性等特点，不易引起非特异性扩增，使得HDA技 术具有更高的特异性和敏感性。2.与其他恒温扩增技术相比，HDA是一种真正意义上的恒温基因扩增方法。例如SDA、LAMP等均需要热变性，而HDA不需此步即可完成反应。此外，尽管HDA的反应体系组稍显复杂，但操作并不繁琐。尤其HDA技术的引物设计简单。SDA技术需要四条引物，靠一组限制性酶消化和置换合成达到扩增目的，同时还需经修饰过的dNTP作底物，而且靶序列的复杂性也限制了其应用范围。TMA技术需要三种酶来完成恒温基因扩增，反应复杂性也限制其使用范围。LAMP技术虽具有简便、快速、高效、特异性很强等优点，但引物设计复杂，难度较大，且对识别靶序列要求极高目的序列长度限制在200bp左右，从中设计的四至六条引物Tm互有差别，且能识别6个不同的区域。而HDA技术的引物设计与常规PCR方法相同，仅需两条普通引物即可。总之，与同类新型PCR技术相比，HDA技术更简单，更有效，是一种崭新的基因扩增方法，极具应用价值和市场前景。目前，国际上对于HDA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有关于HDA检测动物病毒的研究。我们首次建立起快速检测口蹄疫病毒的HDA技术，并通过特异性和灵敏度评价，进而用于临床样本检测，为FMDV病毒的现场快速检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物使用的、检测口蹄疫病毒的寡核苷酸序列。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测口蹄疫病毒的试剂盒。为解决第一个技术问题，本专利技术采用以下技术方案一组检测口蹄疫病毒的引物，为序列表SEQ ID No : I和SEQ ID No :2所示的寡核苷酸序列，详见表I。表I.引物序列权利要求1.一组检测口蹄疫病毒的引物，其特征在于，该引物序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQID NO 2所示，其中SEQ ID NO 1为检测口蹄疫病毒的引物I，SEQ ID NO 2为检测口蹄疫病毒的引物II。2.一种检测口蹄疫病毒的RT-HDA试剂盒，其特征在于，由以下组分组成 (1)TriZol 裂解液； (2)RT-HDA反应液，其包括HDA缓冲液、MgS04、NaCl、dNTP、引物I、引物II ;其中，所述引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ IDN0:2所示； (3)酶混合物，其包括DNA解旋酶，BstDNA扩增酶和反转录酶； (4)无RNA酶的灭菌纯化水； (5)阴性对照无核酸灭菌水； (6)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQIDNo. 3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的检测口蹄疫病毒的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测口蹄疫病毒的引物，其特征在于，该引物序列如序列表SEQ？ID？NO：1至SEQ？ID？NO：2所示，其中SEQ？ID？NO：1为检测口蹄疫病毒的引物I，SEQ？ID？NO：2为检测口蹄疫病毒的引物II。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒲静，乔彩霞，张伟，高志强，刘环，汪琳，谷强，张鹤晓，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
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