本发明专利技术公开一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）TSV病毒组织的获得；（2）TSV病毒检测；（3）TSV病毒液的制备；（4）构建TSV感染模型。通过本发明专利技术的方法建立的对虾TSV病毒感染模型重现性好，RNA病毒致病力比较强，感染效果比较明显；鉴定方法比较简单，判断标准明晰，不仅适用于RNA病毒的抗病选育研究，还可以用于TSV致病机理的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗病毒研究领域，特别涉及到。
技术介绍
凡纳滨对虾因其生长快、抗病力强、适盐性广、肉味鲜美而被引入我国大量养殖， 目前我国的对虾养殖品种中80%都为凡纳滨对虾,然而,对虾在大量养殖过程中，也伴随着病毒性疫病的大量繁殖与传播，病毒性疫病的的爆发仍是目前阻滞对虾养殖业健康发展的最大障碍，其中对奸桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)是对奸养殖业危害最为严重的病原之一。TSV病毒是单链RNA病毒，主要感染靶器官为甲壳上皮(附肢、鳃、胃、食道、后肠)、结缔组织等，引起对虾病虾不摄食，消化道内无食物；游泳无力，反应迟钝，甲壳变软， 虾体发红，尤其是尾扇变红，幼虾(O. 05-5克)发病严重，死亡率高达80%，而幸存者甲壳有黑斑，即虾壳角质有黑化病灶。近年来，该病毒在我国沿海对虾养殖主产区大面积流行，造成的经济损失巨大。鉴于凡纳滨对虾在我国具有重要的经济地位，有必要对其病害防治方法和致病机理进行深入研究，但是TSV病毒属于RNA，不易保存和纯化，因此，建立一个相对于TSV病毒分离、鉴定和保存的完整的方法对于研究对虾RNA病毒的防治是必不可少的。目前，只查到关于对虾白斑综合症病毒感染模型建立的公开文献，而关于对虾桃拉病毒(TSV)感染模型的建立，尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供，通过本专利技术的方法建立的对虾TSV病毒感染模型重现性好，RNA病毒致病力比较强，感染效果比较明显；鉴定方法比较简单，判断标准明晰，不仅适用于RNA病毒的抗病选育研究，还可以用于TSV致病机理的研究。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤(1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释， 用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾，每尾注射 1(Γ 2μ L，注射后对虾养殖水温控制在28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态， 将濒死对虾及时收取置于液氮中；(2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3'，下游引物5' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3';扩增产物在250bp Marker附近出现一条亮带,说明该奸可能被桃拉病毒感染,再通过纯化、克隆和测序确定该序列为桃拉病毒序列，即该虾为桃拉病毒感染阳性对虾。(3) TSV病毒液的制备取2_5g TSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨3成粉末，将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12 30ml的O. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用O. 45 μ m的滤器过滤，利用步骤(2)所述 PCR方法检测病毒液是否为阳性，以确定在制备病毒液过程中核酸完全裂解出来，即病毒粒子完全释放出来，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建 TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d，既而确定感染量，确定病毒感染模型。所述PBS平衡盐溶液为每IL平衡盐溶液中含有O. 2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾， 8. OOg氯化钠，2. 16g 7个水分子的磷酸氢二钠；以上所述步骤(4)的η值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。以上所述步骤(2)扩增的体系为12yL 2 X Taq PCR康为试剂，11 μ L的无菌双蒸水，模板和上下游引物各I μ L，扩增程序为94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s， 35个循环，72°C延伸IOmin0以上所述步骤(I)试验对虾的体重为l(Tl2g。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是通过本专利技术的方法建立的对虾TSV病毒感染模型重现性好，RNA病毒致病力比较强，感染效果比较明显；鉴定方法比较简单，判断标准明晰，不仅适用于RNA病毒的抗病选育研究，还可以用于TSV致病机理的研究。附图说明图I为凡纳滨对虾TSV感染模型的建立，横坐标为对虾感染TSV的天数，纵坐标为对虾的死亡率，系列1-5代表由低到高的不同浓度的病毒液攻毒组，系列6为对照组；图2为TSV感染对虾的肝胰腺组织的RNA提取图；图3为凡纳滨对虾体内TSV的PCR检测图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围，实施例I:，包括以下步骤(1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾(体重l(Tl2g)， 每尾注射l(Tl2yL (以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾)，注射后对虾养殖水温控制在 28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中；(2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，扩增的体系为12 μ L 2 X Taq PCR康为试剂，11 μ L的无菌双蒸水，模板和上下游引物各I μ L，扩增程序为 94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 个循环，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制备取2gTSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末， 将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12ml的O. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用O. 45 μ m的滤器过滤，利用步骤(2)所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d,既而确定感染量，确定病毒感染模型；n值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。如图I所示，随着TSV病毒感染液浓度的降低，凡纳滨对虾死亡高峰的出现时间相对延后，且观察时间内对虾累计死亡率相对降低；当TSV病毒液的稀释度在10_卜10_2时，7d 内对虾几乎全部死亡(大于90%)，而稀释度为10_3倍时死亡率明显降低。根据本专利技术的判定标准7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒液稀释倍数作为RNA干扰用病毒感染浓度。因此，该批对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）TSV病毒组织的获得：将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾，每尾注射10~12μL，注射后对虾养殖水温控制在28?30℃，盐度28‰，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中；（2）TSV病毒检测：用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物：5′?TCAATGAGAGCTTGGTCC?3′，下游引物：5′?AAGTAGACAGCCGCGCTT?3′；（3）TSV病毒液的制备：取2~5g?TSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末，将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12~30ml的0.01M?的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g?离心15min，将上层清液用0.45μm的滤器过滤，利用步骤（2）所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，?80℃冻存备用；（4）构建TSV感染模型：将TSV病毒液按10?(n?2),?10?(n?1)，?10?n，10?(n+1)，10?(n+2)共5个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d，既而确定感染量，确定病毒感染模型。...
【技术特征摘要】
1.一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾，每尾注射l(Tl2ii L，注射后对虾养殖水温控制在28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中； (2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3'，下游引物5' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3'； (3)TSV病毒液的制备取2 5g TSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末，将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12 30ml的0. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用0. 45 y m的滤器过滤，利用步骤(2)所述PCR方法检测病毒液是...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈秀荔，赵永贞，陈晓汉，彭敏，李咏梅，杨春玲，何苹萍，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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