舞毒蛾核型多角体病毒的生产工艺制造技术

本发明专利技术提供一种舞毒蛾病毒的生产方法，其中对舞毒蛾病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度、接毒时间等进行了改进。通过这些改进完善了舞毒蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了舞毒蛾病毒产量，降低了生产成本，为野外大面积推广应用舞毒蛾核型多角体病毒防治舞毒蛾奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种舞毒蛾病毒的生产方法，其用于生产舞毒蛾病毒杀虫剂，属于林木害虫——舞毒蛾生物防治领域。
技术介绍
舞毒蛾(Lymantria dispar L.),又名秋千毛虫、苹果毒蛾、柿毛虫,隶属于鳞翅目 Lepidoptera,毒蛾科Lymantriidae,毒蛾属Lymantria,是世界性食叶害虫，具有分布广、 食性杂、危害重、幼虫随风迁移等特点。由于舞毒蛾对农林业的危害严重，近百年来，人们采用了多种方法对舞毒蛾进行防治。化学农药防治是应用最早也是迄今为止应用最为广泛的防治手段。因其具有经济、有效、方法简便、不受地形限制等特点，当森林虫害发生时，能在短期内取得满意的防治效果，减少经济损失。但大量采用化学制剂防治，产生了严重的一 3R”问题，即抗药性 (Resistance)、再娼獗(Resurgence)和残留(Residue)。近年来，随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，使用和开发高效、低毒、无公害的农药已成为发展的必然趋势。昆虫病毒不仅具有寄主专一性、防治效果好、不污染环境、对其它生物安全、不使害虫产生抗药性等优点，而且病毒还能在环境中积累，通过外界因子的刺激或诱发等多种途径在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口密度，在害虫的可持续控制中发挥重要的作用。在舞毒蛾防治中，核型多角体病毒(NPV)是最常用的一种。利用舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)防治舞毒蛾已有几十年的历史。国外对LdNPV的应用研究较早，60年代初就开始利用舞毒蛾核型多角体病毒进行林间防治，并取得了较为理想的效果。实验证明，舞毒蛾核型多角体病毒是影响舞毒蛾种群动态的主要因子之一，常引起舞毒蛾种群数量的急剧下降，是有效防治舞毒蛾、降低其危害的有效方法。应用舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV) 防治舞毒蛾在世界各地均取得了良好效果，特别是在各种化学合成杀虫剂严重污染环境以及害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下，应用舞毒蛾核型多角体病毒防治舞毒蛾显得尤为重要和迫切。上述试验证明，LdNPV对舞毒蛾不但有良好的防治效果，且对哺乳动物无不良影响，值得推广使用。目前，舞毒蛾核型多角体病毒以在舞毒蛾幼虫体内复制最为经济，且舞毒蛾人工饲养技术已成功解决，但利用人工饲料饲养的舞毒蛾接毒龄期、接毒浓度、接毒时间对舞毒蛾生长、发育、存活以及病毒复制量是否存在影响还未见报道。因此，本专利技术对舞毒蛾病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度、接毒时间等进行了试验筛选。通过这些试验完善了舞毒蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了舞毒蛾病毒产量，降低了生产成本， 为野外大面积推广应用舞毒蛾核型多角体病毒防治舞毒蛾奠定基础。
技术实现思路
本专利技术涉及一种舞毒蛾病毒扩增的生产方法，其特征在于，将浓度为I.OX 106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予饲料上，用带有病毒的饲料来饲养4龄舞毒蛾的幼虫使其感染，10天后收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀。根据本专利技术，所述舞毒蛾病毒优选舞毒蛾核型多角体病毒。进一步优选的，本专利技术涉及一种舞毒蛾病毒的生产方法，其特征在于，包括如下步骤I)舞毒蛾病毒的扩增将配制好的病毒液(浓度为I. OX 106PIB/ml)均匀施予饲料(例如人工饲料)表面， 晾干(以人工饲料表面无水滴为准)后，让4龄幼虫取食感染，扩增室温度优选控制在25°C。2)感毒虫的收集及病毒提取健康虫接毒10天后，收集感毒虫或死亡虫，放入容器中，优选将其放入_18°C的冰箱中保存，必须保证及时收集，避免虫体破损造成病毒液流失。将收集的感毒虫或死亡虫的尸体加无菌水稀释(例如2 3倍)，粉碎(优选在高速组织捣碎机上，做间断匀浆2 3min)，用纱布过滤(优选三层)，然后再用筛子过滤(优选80 目)，滤液加水稀释(例如2 3倍)，再离心(例如使用16000r/min离心机)，弃上清液，得沉淀。将提取的多角体沉淀加适量蒸馏水稀释，利用血球计数器在光学显微镜下进行观察计数。多角体含量不得低于2. 5 X IOkiPIBAiI。本专利技术进一步涉及一种舞毒蛾病毒杀虫剂的制备方法，将上述扩增得到的舞毒蛾病毒用水稀释，加入荧光素钠、防腐剂、乳化剂、甘油，搅拌得到悬浮液剂。在上述制备过程中，优选在无菌环境下进行，所有器皿、分装盛具均优选消毒灭菌，所述水优选使用无菌水。进一步优选的，本专利技术涉及一种舞毒蛾病毒杀虫剂的制备方法将已测数的多角体沉淀物加水稀释至2. δΧΚΓΡΙΒ/πιΙ，称取萤光素钠，再加少量无菌水，充分研磨溶解后， 加入多角体悬液再搅匀；将防腐剂溶于无菌水然后加入前液中搅匀，加入乳化剂搅匀；最后加入甘油，用电动机搅拌(例如20min)。分装，封口，贴标签。在配制过程中，应在无菌环境下进行。饲毒龄期、饲毒浓度以及饲毒时间均是影响LdNPV室内增殖的重要因子。其中饲毒龄期低于4龄时，幼虫体重增加速率缓慢，虫尸重也越小,从而影响最终的病毒获得量。但龄期若太高(5龄)，会有绝大部分个体发育至蛹期，最终也影响病毒的产量。舞毒蛾饲毒以4龄幼虫为最佳。同饲毒龄期一样，饲毒浓度对舞毒蛾幼虫体重、虫尸重以及含毒量也存在一定影响。饲毒浓度高于1.0X106PIB/ml时，会抑制幼虫的取食，促进幼虫死亡的速度，从而影响体重增长，虫尸重也越低。但饲毒浓度若低于该浓度时，最终死亡幼虫体重同此浓度无显著差异，但死亡时间会增加4 - 8d，从而增加一次喂饲次数，提高人工饲养成本。饲毒浓度以I.0X106PIB/ml 为最佳。饲毒时间优选10天，此时收集的饲毒虫体重最高，体内浓度含量也最高。根据本专利技术，所述饲料可以为人工饲料，或者为本专利技术人于2011年11月19日提交的，申请号为201110318830. 5，专利技术名称为“舞毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的生产工艺” 的在先申请中提及的饲料或人工饲料，其全文引入本文作为参考。根据本专利技术，所述人工饲料可以为干酪素35g、韦氏盐10g、蔗糖12g、果糖23g、麦胚60g、氯化胆碱lg、对轻I. 5g、琼脂25g、金霉素O. 3g、抗坏血酸4g、4M KOH 5ml、38%甲醒O.5ml、55%亚麻酸4. 3ml、混合维生素IOml (烟酸100g、泛酸I丐100g、核黄素50g、盐酸硫胺素25g、盐酸吡哆醇25g、叶酸25g、生物素2g、B120. 2g)、水860ml ;或者饲料干酪素40g、蔗糖30g、韦氏盐10g、山梨酸2g、麦胚100g、琼脂16g、对羟 lg、混合维生素IOg (抗坏血酸280g、氯化胆碱55g、叶酸250ml、肌醇20g、烟酸lg、卩比卩多辛 230mg、胆固醇 50g、B121. 5g)、水 800ml。根据本专利技术，所述人工饲料包括韦氏盐4-15重量份、麦胚80-180重量份、干酪素 30-90重量份、鹿糖5-15重量份、抗坏血酸4-15重量份、氯化胆碱0. 3_6重量份、肌醇0. 3-6 重量份、胆固醇0.5-6重量份。优选地，进一步包括琼脂8-25重量份、水适量。更优选地， 所述饲料还包括山梨酸0. 3-6重量份。更优选的，本专利技术的人工饲料包括韦氏盐6-10重量份、麦胚100-140重量份、干酪素35-70重量份、蔗糖8-13重量份、抗坏血酸6-10重量份、氯化胆碱0. 5-4重量份、肌醇0.5-4重量份、胆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种舞毒蛾病毒扩增的生产方法，将浓度为1.0×106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予饲料上，用上述带有病毒的饲料来饲养4龄舞毒蛾的幼虫使其感染，10天后收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀。

【技术特征摘要】
1.ー种舞毒蛾病毒扩增的生产方法，将浓度为I. OX 106PIB/ml的舞毒蛾病毒施予饲料上，用上述带有病毒的饲料来饲养4龄舞毒蛾的幼虫使其感染，10天后收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀。2.如权利要求I所述的生产方法，包括如下步骤 1)、舞毒蛾病毒的扩增 将配制好的病毒液(浓度为I. OX 106PIB/ml)均匀施予饲料(例如人工饲料)表面，晾干(以人工饲料表面无水滴为准)后，让4龄幼虫取食感染，扩增室温度优选控制在25°C ； 2)、感毒虫的收集及病毒提取 健康虫接毒10天后，收集感毒虫或死亡虫，放入容器中，优选将其放入_18°C的冰箱中保存， 将收集的病死虫尸加无菌水稀释(例如2 3倍)，粉碎(优选在高速组织捣碎机上，做间断匀浆2 3min)，用纱布过滤(优选三层)，然后再用筛子过滤(优选80目)，滤液加水稀释(例如2 3倍),再离心(例如使用16000r/min离心机),...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁洪柱，陈倩，田会鹏，梁晓梅，
申请(专利权)人：北京市西山试验林场，
类型：发明
国别省市：