香港牡蛎精子超低温冷冻保存以及激活方法技术

本发明专利技术公开香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，包括香港牡蛎精子采集、稀释和冷冻，其特征在于：所述稀释是用由基础液和抗冻剂组成的稀释液对香港牡蛎精子进行稀释、平衡；所述冷冻是采用程序降温法进行冷冻，最终在液氮中保存。经上述步骤冷冻保存的香港牡蛎精子激活方法，包括解冻和激活步骤，所述解冻，是将液氮保存精子取出，在35～55℃恒温水浴解冻至完全融解；所述激活，是向复苏后精子中添加终质量浓度为0.1563～0.6250‰的氨海水。通过本发明专利技术提高了香港牡蛎精子成活率、活力、受精率及孵化率，可以加快香港牡蛎的育种进程，为今后香港牡蛎育种的发展及良种的规模化苗种繁育提供帮助，在香港牡蛎种质资源的保存和生物多样性的保护研究方面意义重大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于精子超低温冷冻
，特别是一种。
技术介绍
香港牡贩(Cra1S1SO1Sirea riraJaris)隶属瓣觸纲,牡贩目，牡贩科。是我国常见的具有经济价值的贝类。香港牡蛎是广西海水养殖业的主要养殖对象，广西沿海是香港牡蛎主要原产地。近年来，养殖的香港牡蛎发生大规模死亡，产量不断下滑，效益下降。种质退化及苗种短缺是香港牡蛎养殖业发展的首要制约因素，开展香港牡蛎良种选育及规模化苗种繁育的研究迫在眉睫。目前精子冷冻在猪、牛、羊、犬等哺乳动物和人类中技术较为成熟，水生动物中的鱼类、马氏珠母贝、太平洋牡蛎精子冷冻也有报道，查到如下相关文献: 1.申请号:200710156398.8，专利技术名称:猪精液冷冻保存管及其猪精液冷冻保存方法，其猪精液冷冻保存方法的要点是:将猪精液预处理和精液冷却处理后的冷冻稀释后的精液装入该专利技术的猪精液冷冻保存管的环形容器中，然后将猪精液冷冻保存管插入液氮上，熏蒸数分钟后，直接投入液氮中长期保存。优点在于:具有在冷冻过程中增加精液和液氮的接触面积，加快精液冷冻速率，降低冷冻对精子的损伤，提高冷精活率；还具有成本低，操作便当，功效闻，保证受:胎率等优点。2.申请号:200710043611.4，专利技术名称:褐牙鲆精子快速冷冻保存方法，其技术方案是将天然海水稀释，以不能激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液；采用浓度为14g/100ml乙二醇作为冷 冻剂；将稀释液+抗冻剂作为褐牙鲆精子的低温冷冻保护液，将冷冻保护液在4°C的恒温箱预冷；精子与保护液按1:1至1: 3比例均匀混合放入离心管中，将离心管置于液氮罐口下_20°C平衡lmin，然后快速投入液氮中保存。该专利技术的优点是操作简便，能快速保存褐牙鲆精子。3.申请号:201110258042.1，专利技术名称:太平洋鳕鱼精子保存冷冻剂及太平洋鳕鱼精子保存方法，其冷冻剂由冷冻稀释液和抗冻剂按照9: I (体积比)的比例混合而成，其中冷冻稀释液的组分含量为:NaCl:42-48mM, KHCO3:2.5-3.5mM, CaCl2:2.5-3.5mM，葡萄糖:35-45mM, Tris:1.5-2.5mM，谷胱甘肽:1.5-2.5mM，牛血清蛋白:1.5-2.5g/L，所述的冷冻稀释液的PH值范围是:6.7-6.9 ;所述的冷冻剂中的抗冻剂为二甲亚砜(DMS0)。以及利用这种冷冻剂进行太平洋鳕鱼精子超低温保存的方法。这种冷冻剂及这种保存方法，能够长期保存太平洋鳕鱼精子，并能保证解冻后精子活力仍能够达到80%以上。 4.李赞，贺桂珍，王品虹；超低温保存前后太平洋牡蛎精子(Grassos treagigas(Thunberg))超微结构观察，青岛海洋大学学报，2002，32 (4):526 532 ;仅提到应用扫描电镜和透射电镜技术，研究超低温冷冻前后太平洋牡蛎精子形态与超微结构。超低温冷冻保存，是指在超低温(_196'198°C )条件下抑制精子细胞内一切新陈代谢活动，并使精子细胞被长期保存而不丧失活性的一种保存技术。在超低温条件下精子细胞之所以能长期保存，是因为精子细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低温所抑制，即随着温度的逐渐下降，细胞内的化学反应能力也在逐渐降低，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存；低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能力。影响冷冻效果的因素主要包括精子的来源、冷冻稀释液和防冻剂的选择、冷冻和解冻方法的选择。在精子的冷冻过程中外来的压力，如冷休克、防冻剂的毒性、冰晶的形成、渗透压的改变，都会造成精子结构和功能的损伤，其损伤程度则由精子自身对外来压力的耐受能力来决定。不同物种其冷冻保存的基础液、抗冻保护剂、降温方法、及复苏都有差异。目前，尚未查到关于的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决香港牡蛎良种选育中优良种质的保存技术难题，提供一种，通过本专利技术提高了香港牡蛎精子成活率、活力、受精率及孵化率，可以加快香港牡蛎的育种进程，为今后香港牡蛎育种的发展及良种的规模化苗种繁育提供帮助，在香港牡蛎种质资源的保存和生物多样性的保护研究方面意义重大。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的: 一种香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，包括香港牡蛎精子采集、稀释和冷冻，所述稀释是用由基础液和抗冻剂组成的稀释液对香港牡蛎精子进行稀释、平衡；所述冷冻是采用程序降温法进行冷冻，最终在液氮中保存。在本专利技术中，香港牡蛎精子的采集也是重要的一个环节，同一物种不同个体间的精液品质有很大不同。一般情况下，冷冻前精液质量越好，解冻后精子的活力就会越好。因此，本专利技术中所选取的香港牡蛎，个体长5 7cm，宽3 5cm，高l(Tllcm。作为进一步的说明，以上所述基础液是由柠檬酸钠和甘氨酸组成的溶液或生理盐水溶液。作为优选，以上所述柠檬酸钠和甘氨酸组成的溶液，其配方为:柠檬酸钠0.Γ0.3mol/L,甘氨酸0.2^0.4mol/L,余量为无菌蒸馏水。作为优选，以上所述生理盐水溶液的质量浓度为0.6^0.9%。在本专利技术中，所选用的基础液及所限定的浓度范围，主要作用是优化香港牡蛎精子所处环境的渗透压与PH值，为香港牡蛎精子提供能量，防止精子细胞内磷脂的流失并起着防冻剂的作用，防止细菌污染，给精子适应外界环境创造有利条件。作为优选，以上所述抗冻剂由二甲基亚砜和海藻糖组成，二甲基亚砜在稀释液中的体积含量为10% 14%，海藻糖在稀释液中含量为0.25 0.45mol/L。因不同物种的精子对不同防冻剂毒害作用的承受能力和其渗透性也不同，本专利技术经过筛选、组合和调节，对抗冻剂进行优化，可以有效减少香港牡蛎精子冷冻过程中的冷冻损伤，并且毒害作用低，对香港牡蛎精子复苏过程的影响也较小。作为进一步的说明，以上所述稀释液是按体积比2(Γ80: I加入精液中进行稀释。作为进一步的说明，以 上所述平衡是将稀释液与精液混匀后在3飞。C条件下平衡l(T60min。其目的是保证精子有一段适应低温的过程，同时又能使抗冻剂充分渗透进香港牡蛎精子细胞内发挥作用，减少、甚至避免了精子的冷休克损伤，进而起到抗冻保护作用。作为进一步的说明，以上所述程序降温法是将稀释后的精液从4°C以_5°C /min的降温速率降至_20°C，在_20°C平衡5min，再从_20°C以-10°C /min的速率降至_80°C，在-80°C平衡5min，最后将其从程序降温仪中取出放进棉布网兜内，再投入-196°C _198°C液氮罐中保存。在精子的冷冻过程中，冷冻速率会影响到精子细胞内外溶液的渗透压和PH的平衡，是超低温冷冻保存的一个决定性因素。程序降温法是利用程序降温仪，按照预先设计的降温程序将精子所处的环境降至一定温度，然后将其放入液氮中保存。这是一种降温速度较慢的冷冻模式。过慢的冷却过程会使溶液的电解质浓度逐渐增高，而当精子在高浓度的溶液中暴露时间过长时，会导致精子细胞膜脂蛋白复合体被破坏和膜被分解。当细胞膜脱水收缩达到临界最小体积时，又会使细胞膜的渗透性产生不可逆的损伤，原来不能透过膜的溶质变成可渗透性的、进而造成细胞损伤或死亡。冷却速度越慢，由电解质浓度增高所引起的渗透压损伤就越大；如果提高降温速度，则可造成细胞内冰晶的形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，包括香港牡蛎精子采集、稀释和冷冻，其特征在于：所述稀释是用由基础液和抗冻剂组成的稀释液对香港牡蛎精子进行稀释、平衡；所述冷冻是采用程序降温法进行冷冻，最终在液氮中保存。

【技术特征摘要】
1.一种香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，包括香港牡蛎精子采集、稀释和冷冻，其特征在于:所述稀释是用由基础液和抗冻剂组成的稀释液对香港牡蛎精子进行稀释、平衡；所述冷冻是采用程序降温法进行冷冻，最终在液氮中保存。2.根据权利要求1所述的香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，其特征在于:所述基础液是由柠檬酸钠和甘氨酸组成的溶液或生理盐水溶液。3.根据权利要求2所述的香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，其特征在于:所述柠檬酸钠和甘氨酸组成的溶液，其配方为:柠檬酸钠0.Γ0.3mol/L，甘氨酸0.2^0.4mol/L，余量为无菌蒸懼水。4.根据权利要求2所述的香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，其特征在于:所述生理盐水溶液的质量浓度为0.6^0.9%。5.根据权利要求1-4中任一项所述的香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，其特征在于:所述抗冻剂由二甲基亚砜和海藻糖组成，二甲基亚砜在稀释液中的体积含量为10% 14%，海藻糖在稀释液中含量为0.25 0.45mol...

【专利技术属性】
技术研发人员：李咏梅，杨春玲，陈秀荔，彭敏，蒋伟明，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水产研究所，
类型：发明
国别省市：