本发明专利技术公开了一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：试剂A，试剂B，试剂C，试剂D，试剂E，试剂F，试剂G，装有试剂H的检测管。本发明专利技术试剂盒检测的特异性和灵敏度高，采用磁珠提取核酸，可充分地将待测样品中的核酸提取出来，避免了使用大型的仪器设备，精简了繁琐复杂的操作流程，同时也极大缩短了核酸提取的时间；使用钙黄绿素染料可以严格遵守LAMP反应的不开盖原则，极大降低了假阳性率；本发明专利技术的试剂盒的整个操作过程简便，在1.5‑2个小时之内就可以完成检测，并且不需要高端的仪器设备。
【技术实现步骤摘要】
一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒
本专利技术涉及水产养殖中病原的检测技术，具体涉及虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)的检测试剂盒。
技术介绍
虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)，全称为肠道上皮细胞微孢子虫，属微孢子虫科，肠胞虫属，2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离而命名。2013年，EHP在国内首次被发现。感染EHP的对虾表现摄食正常，但体色发白，肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，一般不会有大规模死亡现象，但是会造成对虾生长缓慢，造成饲料损耗，产量低，从而给渔民造成较大的经济损失。目前针对EHP还没有有效的治疗手段，及早发现并采取必要措施阻止病原传播是公认最有效的方法。因此建立灵敏、准确、快速、便捷的检测技术是减少虾肝肠胞虫病暴发的重要途径。目前，诊断EHP的方法主要有：组织切片观察、原位杂交、PCR、实时荧光定量PCR等技术。这些方法多数需要昂贵精密的设备仪器，并且操作复杂，耗时长，需要专业技术人员操作，并不能满足现场快速诊断的要求。因此，目前迫切需要一种操作简单、结果准确可靠、结果判断直观、成本低廉的现场快速检测方法，为疾病的防控提供技术保障。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，在60-65℃的恒温条件下，经过30-50分钟就可以完成核酸扩增反应。在LAMP反应体系中事先加入与Mn2+螯和的钙黄绿素，Mn2+可以使钙黄绿素的绿色荧光淬灭，当LAMP扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn2+结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出绿色荧光，通过颜色的变化来判断反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便等特点，广泛应用于各种病原体的检测。目前，已有研究人员开发建立了EHP的LAMP检测技术，但由于传统病毒核酸的提取需要实验室的专业设备，操作较为繁琐复杂等问题，阻碍了LAMP检测技术在养殖过程中的推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种不需要实验室专业仪器设备，操作简便快速的虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒。本专利技术的技术方案概述如下：一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：试剂A：组织裂解液Ⅰ；试剂B：组织裂解液Ⅱ；试剂C：异丙醇；试剂D：体积百分比浓度为65％-80％的乙醇水溶液；试剂E：灭菌双蒸水；试剂F：90-110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO42μl，5M的甜菜碱1μl，100μM的引物EHP-FIP0.4μl，所述引物EHP-FIP的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示；100μM的引物EHP-BIP0.4μl，所述引物EHP-BIP的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示；100μM的引物EHP-LF0.2μl，所述引物EHP-LF的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；100μM的引物EHP-LB0.2μl，所述引物EHP-LB的核苷酸序列用SEQIDNO.4所示；100μM的引物EHP-F30.05μl，所述引物EHP-F3的核苷酸序列用SEQIDNO.5所示；100μM的引物EHP-B30.05μl，所述引物EHP-B3的核苷酸序列用SEQIDNO.6所示；8U/μl的BstDNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料灭菌双蒸水11.7μl混合的试剂H；研磨棒，一次性吸管，牙签，1.5ml样品管和磁力架。虾肝肠胞虫阳性质粒是用下述方法制成：将人工合成的用SEQIDNO.7所示的核苷酸序列连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为虾肝肠胞虫阳性质粒。本专利技术的优点：我们优选了虾肝肠胞虫的SSU基因保守序列区设计了6条特异性引物，相比较4条特异性引物不仅提高了检测的特异性和灵敏度，而且极大缩短了反应时间；采用磁珠提取核酸的方法，可以充分地将待测样品中的核酸提取出来，避免了使用大型的仪器设备，精简了繁琐复杂的操作流程，同时也极大缩短了核酸提取的时间；使用钙黄绿素染料可以严格遵守LAMP反应的不开盖原则，避免了SYB-Green等其它显色原理类似的染料必须在扩增反应结束后开盖再加入的情况，极大降低了假阳性率；该试剂盒的整个操作过程十分简便，在1.5-2个小时之内就可以完成虾肝肠胞虫的检测，并且不需要任何高端的仪器设备，仅需要一个水浴锅或金属浴就可以完成，适合在实际生产的过程中推广使用。附图说明：图1本专利技术的试剂盒检测结果的颜色判定，其中1号管为空白对照反应结果，2号管为阳性对照反应结果，3号管为实施例4检测结果。具体实施方式组织裂解液Ⅰ和组织裂解液Ⅱ购自天根生物试剂公司；核酸提取磁珠购自厦门鑫海东方生物科技有限公司；BstDNA聚合酶(含10×Buffer)，40mM的脱氧核糖核苷酸，100mM的MgSO4购自NewEnglandBiolabs；5M的甜菜碱购自Sigma；钙黄绿素染料购自荣研生物科技有限公司；pMD-18T载体，TOP10细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。质粒提取试剂盒购自天根生物试剂公司。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。虾肝肠胞虫阳性质粒优选下述方法制成：将人工合成的用SEQIDNO.7所示的核苷酸序列连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为虾肝肠胞虫阳性质粒。人工合成的用SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的来源：文献中查阅虾肝肠胞虫的SSU基因保守序列，根据这段基因保守序列设计以SEQIDNO.8所示的核苷酸序列为上游引物F，以SEQIDNO.9所示的核苷酸序列为下游引物R，以虾肝肠胞虫的DNA为模板，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，其核苷酸序列用SEQIDNO.7所示，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为虾肝肠胞虫阳性质粒。各实施例中，引物EHP-FIP的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示；引物EHP-BIP的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示；引物EHP-LF的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；引物EHP-LB的核苷酸序列用SEQIDNO.4所示；引物EHP-F3的核苷酸序列用SEQIDNO.5所示；引物EHP-B3的核苷酸序列用SEQIDNO.6所示；实施例1一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：试剂A：组织裂解液Ⅰ；试剂B：组织裂解液Ⅱ；试剂C：异丙醇；试剂D：体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液；试剂E：灭菌双蒸水；试剂F：100mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO42μl，5M的甜菜碱1μl，100μM本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，其特征是包括：试剂A：组织裂解液Ⅰ；试剂B：组织裂解液Ⅱ；试剂C：异丙醇；试剂D：体积百分比浓度为65％‑80％的乙醇水溶液；试剂E：灭菌双蒸水；试剂F：90‑110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer 2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO4 2μl，5M的甜菜碱1μl；100μM的引物EHP‑FIP 0.4μl，所述引物EHP‑FIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；100μM的引物EHP‑BIP 0.4μl，所述引物EHP‑BIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示；100μM的引物EHP‑LF 0.2μl，所述引物EHP‑LF的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示；100μM的引物EHP‑LB 0.2μl，所述引物EHP‑LB的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示；100μM的引物EHP‑F3 0.05μl，所述引物EHP‑F3的核苷酸序列用SEQ ID NO.5所示；100μM的引物EHP‑B3 0.05μl，所述引物EHP‑B3的核苷酸序列用SEQ ID NO.6所示；8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料...
【技术特征摘要】
1.一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，其特征是包括：试剂A：组织裂解液Ⅰ；试剂B：组织裂解液Ⅱ；试剂C：异丙醇；试剂D：体积百分比浓度为65％-80％的乙醇水溶液；试剂E：灭菌双蒸水；试剂F：90-110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO42μl，5M的甜菜碱1μl；100μM的引物EHP-FIP0.4μl，所述引物EHP-FIP的核苷酸序列用SEQIDNO.1所示；100μM的引物EHP-BIP0.4μl，所述引物EHP-BIP的核苷酸序列用SEQIDNO.2所示；100μM的引物EHP-LF0.2μl，所述引物EHP-LF的核苷酸序列用SEQIDNO.3所示；100μM...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛淑霞，孙妍，
申请(专利权)人：天津市水生动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：天津,12
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