抗体制剂制造技术

本发明专利技术提供一种适合于人静脉内施用的抗体制剂，所述抗体制剂包含IgG抗体、IgA抗体和占抗体总量至少5重量%的IgM抗体，其中，所述制剂从人血浆制得，其中，所述抗体制剂具有特异性补体活化活性，并且其中，在适合于确定所述抗体制剂的非特异性地激活补体的能力的用人血清进行的体外测定中，所述抗体制剂基本不产生C5a且/或基本不产生C3a。本发明专利技术还提供所述抗体制剂的医药应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体制剂
本专利技术涉及一种包含IgM的抗体(免疫球蛋白)制剂，所述制剂具有特异性补体活化活性但具有低的非特异性补体活化能力。本专利技术还涉及所述抗体制剂在医药中的应用。
技术介绍
从人类血浆制备的且适合于静脉内施用的免疫球蛋白组合物在本领域中是已知的，且数十年来在多种疾病的治疗中起着重要作用。免疫球蛋白用于例如治疗人体感染，并且可以分为具有不同生化和生理性质的多种类别。免疫球蛋白G参与抵御病毒抗原，而IgM则主要在抗细菌和抗毒素的免疫应答中具有活性。免疫球蛋白溶液包含占各种百分比的IgG、IgA和IgM，且不同的制剂具有不同的治疗应用，例如，IgM百分比较高的制剂用于预防或治疗细菌感染。免疫球蛋白溶液通常从血浆或血清的组分(例如Cohn组分)中制得。随后对这些组分进行多个纯化步骤来除去包括病毒、变性蛋白、蛋白酶和脂质在内的污染物。用于组分分离的人类血清采集自数千供体，尽管对来源血浆进行了全面检测，但仍可能含有病原体病毒。因此，为了获得安全的用于医药应用产品，用于使病毒灭活或除去病毒的处理步骤必不可少。用于病毒灭活/去除的若干种技术在本领域中是已知的，例如化学处理、UVC光照射或纳米过滤，实施这些技术是为了确保总体病毒安全性。通过使用生产过程的实验室规模模型验证了这些处理步骤的病毒去除或灭活能力，并且对每个步骤都确定了去除或灭活系数。灭活/去除系数的提高为药物产品增添了额外的病毒安全性。现今，来自主管机构的准则要求在制造源自血浆的药物时至少有两个针对有包膜和无包膜的病毒的有效步骤。虽然若干种方法(例如溶剂/去垢剂处理、辛酸处理、纳米过滤和热处理)可有效地灭活或除去有包膜病毒，但是仅有几种已知方法可灭活或除去无包膜病毒，例如细小病毒。这些无包膜病毒大部分都非常小，通常会穿过孔径大于20nm的纳米过滤器。而该孔径对于直径可高达30nm的IgM分子而言过小。无包膜病毒可被例如β-丙内酯等化学物质有效地灭活，但是，这也会产生功能受到破坏的经修饰的免疫球蛋白。另一种有效的处理是UVC照射(EP1842561,CAF-DCF)。然而，已知的溶剂/去垢剂处理、辛酸处理和温和热处理对无包膜病毒基本没有效果。如上所述，除了潜在的病毒以外，还有必要除去例如脂质、蛋白酶、蛋白聚集体和变性的免疫球蛋白等其他污染物。为了(1)确保产品符合有关病毒污染的生物安全性准则、(2)在静脉内施用后使患者对产物耐受、(3)使产品在长期储存过程中稳定(任何残留的蛋白水解活性都可能导致产品在长期储存(例如2年)过程中降解)和(4)产生所需的化合物混合物/药物组合物，除去所有上述污染物是必须的。然而，与此同时，至关重要的是用来除去污染物的纯化步骤不会干扰免疫球蛋白分子，从而尽可能地使这些免疫球蛋白分子保留其正常生物活性并以高产率保留在溶液中。该平衡难以实现，因为许多已知的纯化步骤还对免疫球蛋白特别是IgM的活性会有负面影响；例如，过长时间的UVC照射可以使在最终免疫球蛋白溶液中所得到的天然的具有活性的IgM的产率降低。这不仅导致最终免疫球蛋白溶液的功效降低，而且还使该溶液在体内的耐受性变差。对患者而言，聚集体和变性的免疫球蛋白(其量可能通过某些纯化步骤增加)尤其是潜在的风险，因为它们的非特异性地激活补体的能力很高，从而在接受这些变性免疫球蛋白的患者中产生严重的副作用。非特异性补体活化是指在特异性抗体-抗原复合物不存在的情况下补体级联反应的启动。应严格避免非特异性补体活化，因为其可以引起不合需要的副作用，例如高血压、潮红、头痛、发热、发冷、恶心、呕吐、肌肉痛、呼吸困难和心动过速。另一方面，特异性补体活化合乎需要，其仅在免疫球蛋白已结合其特异性抗原后发生。非特异性补体活化以所谓的抗补体活性(ACA)计，ACA通过《欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia)》中描述的标准化测试来测量。补体系统在对病原体的免疫防御中的作用是公知的。补体系统由约20种蛋白组成，这些蛋白依次发生活化。经典补体途径通常需要特异性抗原抗体复合物来激活，而旁路途径可以在无抗体存在的情况下由抗原来激活。补体活化的经典途径和旁路途径都产生蛋白酶-C3转化酶。C3转化酶切断并激活补体成分C3，产生C3a和C3b，并且在C5转化酶上引起进一步的断裂和活化事件的级联反应以形成C5a和C5b。C5b引发膜攻击途径，该途径产生由C5b、C6、C7、C8和多聚的C9组成的膜攻击复合物。这是补体级联反应的细胞溶解性末端产物，其形成跨膜通道，该通道引起靶细胞(如细菌)的渗透性溶解。补体活化还导致过敏毒素的形成，包括生物活性蛋白C5a。该过敏毒素是免疫和炎性细胞的有力趋化剂，并且诱导细胞活化并使组胺从肥大细胞中释放出。在过量或不受控制的和/或非特异性的补体活化的情况下，C5a的过度产生能够引起对患者有害的效果。C5a是有效的白细胞化学吸引剂，在补体活化的部位引起白血球、尤其是中性粒细胞的积累。C5a激活白血球，而且是强效的炎症介质。尽管这些功能在特异性抗体-抗原复合物的反应过程中有益，但由于潜在的副作用，必须避免C5a的所有非特异性产生。因为与IgG制剂相比IgM抗体容易在溶液中聚集，所以对于IgM免疫球蛋白制剂(即，包含至少5%IgM的制剂)而言，非特异性补体活化特别成问题。IgM制剂难以稳定化，尤其是在其相对于血浆浓度有所富集和储存在液体溶液中时。还已知IgM是补体的强力活化剂；与抗原结合的单个分子即可激活补体。这与IgG不同，两个以上的IgG分子必须在彼此近距离联结的情况下结合抗原才能激活补体。此外，含IgM的免疫球蛋白制剂所治疗的主要适应证是细菌感染和败血病。由于这些患者已经患有高血压，所以非特异性补体活化和C5a的额外的不需要的产生将使患者状况的临床恶化。因此，据已有描述，难以将IgM制剂制备成用于静脉内应用。本领域中描述了用于从人血浆中制造含IgM的免疫球蛋白制剂的若干种方法。已使用经典的Cohn血浆组分分离法或其公知的变形方法(例如Cohn/Oncley，Kistler/Nitschmann)对人IgM溶液进行了初步纯化。使用冷乙醇沉淀法，将IgM组分回收在组分III或组分I/III(亦称为B或B+I)中。已描述了用来从组分III或I/III开始对富集有IgM的蛋白溶液进行纯化的方法。EP0013901描述了从组分III开始的纯化方法，包括使用辛酸的步骤、使用β-丙内酯的步骤和使用阴离子交换树脂的吸收步骤。该方法用于生产——迄今为止唯一的市售静脉内IgM产品。β-丙内酯是为了使潜在的病毒灭活而用于灭菌步骤的公知化学物质。由于β-丙内酯是可引起蛋白化学修饰的反应性很强的物质，所以免疫球蛋白的抗病毒活性和抗细菌活性也会有大量损失。另一方面，与未经化学修饰的免疫球蛋白相比，该化学修饰产生了降低的抗补体活性。EP0352500描述了通过以下方法制备具有降低的抗补体活性的用于静脉内应用的IgM浓缩物：使用阴离子交换层析、β-丙内酯、UVC光照射和在升高的温度(40℃～60℃)下进行温育的步骤。用该方法制造的制剂因所述化学修饰而在液体溶液中仅在有限的时间内保持稳定。IgM的浓度超过总免疫球蛋白含量的50%。在EP0413187(Biotest，生物测试股份公司)和EP0413本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.22 GB 1006753.61.一种适合于人静脉内施用的抗体制剂，所述抗体制剂包含IgG抗体、IgA抗体和占抗体总量至少5重量％的IgM抗体，其中，所述制剂通过包括以下步骤的方法从人血浆制得：(a)从人血浆制备血浆组分，作为含免疫球蛋白的溶液；(b)将辛酸与所述溶液混合，并用振动搅拌器处理经混合的溶液以沉淀出污染性蛋白，其中所述辛酸以0.075kg/kg血浆组分至0.2kg/kg血浆组分的浓度添加，经混合的溶液的pH为4.5～5.5，温度为10℃～35℃；(c)将沉淀出的蛋白从所述溶液中分离出，以产生含有IgM的免疫球蛋白组合物；(d)将所述含有IgM的免疫球蛋白组合物在pH3.5～4.5温育，以形成经温育的溶液；(e)用UVC照射经温育的溶液，从而形成经UVC照射的溶液；和(f)在无菌条件下过滤所述经UVC照射的溶液，从而形成适合于人静脉内施用的抗体制剂，其中，所述抗体制剂具有特异性补体活化活性，其中，制备所述抗体制剂的所述方法能够实现无包膜病毒的大于3log10的去除，并且其中，在适合于确定所述抗体制剂的非特异性地激活补体的能力的用人血清进行的体外测定中，所述抗体制剂产生的C5a和/或C3a的量为仅用人血清时产生的C5a和/或C3a的量的30％至170％。2.如权利要求1所述的抗体制剂，所述抗体制剂包含占抗体总量的大于5重量％的IgA和大于40重量％的IgG。3.如权利要求1所述的抗体制剂，所述抗体制剂包含占抗体总量的至少10重量％的IgM。4.如权利要求3所述的抗体制剂，所述抗体制剂包含占抗体总量的至少15重量％的IgM。5.如权利要求1所述的抗体制剂，其中，经调整IgM浓度为1.72mg/ml的所述抗体制剂在60分钟的所述测定后产生少于200ng/ml的C5a。6.如权利要求1所述的抗体制剂，其中，经调整IgM浓度为1.72mg/ml的所述抗体制剂在60分钟的所述测定后产生少于6000ng/ml的C3a。7.如权利要求1所述的抗体制剂，其中，用于确定所述抗体制剂产生的C5a的量的所述体外血清测定包括以下步骤：(a)将一定量的所述抗体制剂添加到100μl人血清中以产生含有1.72mg/mlIgM的反应混合物，并在持续搅拌下将所述反应混合物于37℃温育60分钟；(b)制备所述反应混合物的适合用于ELISA的稀释液组；(c)用针对C5a的一抗和二抗以及显色物质对所述反应混合物的所述稀释液组进行夹心式ELISA，其中，所述二抗与酶偶联，且所述显色物质是所述酶的底物；和(d)根据因使所述显色物质与通过所述二抗结合C5a的所述酶接触而获得的颜色变化，确定所述反应混合物中的C5a的量。8.如权利要求1所述的抗体制剂，其中，用于确定所述抗体制剂产生的C3a的量的所述体外血清测定包括以下步骤：(a)将一定量的所述抗体制剂添加到100μl人血清中以产生含有1.72mg/mlIgM的反应混合物，并在持续搅拌下将所述反应混合物于37℃温育60分钟；(b)制备所述反应混合物的适合用于ELISA的稀释液组；(c)用针对C3a的一抗和二抗以及显色物质对所述反应混合物的所述稀释液组进行夹心式ELISA，其中，所述二抗与酶偶联，且所述显色物质是所述酶的底物；和(d)根据因使所述显色物质与通过所述二抗结合C...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·莫勒尔，D·鲁德尼克，O·曼尼格，M·罗德梅尔，马蒂亚斯·杰默，V·布劳恩，
申请(专利权)人：生物测试股份公司，
类型：
国别省市：