去免疫化的因子VIII分子以及包含其的药物组合物制造技术

本发明专利技术涉及治疗性蛋白领域，尤其涉及重组凝血因子。其提供了在限定位置包含特定点突变的重组因子VIII(FVIII)蛋白，所述特定点突变用于降低所述FVIII蛋白的免疫原性，其中所述因子VIII蛋白基本上保留了其凝血活性。其还提供了编码所述去免疫化的蛋白的核酸、细胞系和重组制备方法以及包含本发明专利技术的重组FVIII的药物组合物，其对于用于治疗甲型血友病患者(特别是尚未使用FVIII产品治疗过的患者)是有利的。另外，对于此前已治疗的患者，甚至对于已经对FVIII(例如，对于免疫耐受诱导疗法(ITI/ITT)或挽救ITI)产生免疫应答的患者，其均是安全的选择。本发明专利技术还提供了用于确定蛋白免疫原性的测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去免疫化的因子VIII分子以及包含其的药物组合物
技术介绍
本专利技术涉及治疗性蛋白领域，尤其涉及重组凝血因子。其提供了在限定位置包含特定点突变的重组因子VIII(FVIII)蛋白，所述特定点突变用于降低所述FVIII蛋白的免疫原性，其中所述因子VIII蛋白基本上保留了其凝血活性。其还提供了编码所述去免疫化的蛋白的核酸、细胞系和重组制备方法以及包含本专利技术的重组FVIII的药物组合物，其对于用于治疗甲型血友病患者(特别是尚未使用FVIII产品治疗过的患者)是有利的。另外，对于此前已治疗的患者，甚至对于已经对FVIII(例如，对于免疫耐受诱导疗法(ITI/ITT)或挽救ITI)产生免疫应答的患者，其均是安全的选择。本专利技术还提供了用于确定蛋白免疫原性的测定。FVIII是凝血级联反应中的重要辅因子。野生型人FVIII是作为由2351个氨基酸组成的单链合成的，其包含被短酸性序列(a1-a3)截断的三个A结构域(A1-A3)、一个B结构域和两个C结构域(C1和C2)。前19个氨基酸是信号序列，该信号序列被细胞内蛋白酶切割，导致FVIII分子具有2332个氨基酸。所得到的结构域结构是A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2。在翻译后修饰期间，FVIII被糖基化、硫酸化和蛋白水解加工。整个FVIII蛋白含有25个潜在的N-糖基化位点。这些位点中的19个位于B结构域中，另外6个位点沿蛋白的其余部分分布。由于并非所有这些位点都被糖基化，因而FVIII仅具有21个N-糖基化。此外，B结构域含有7个O连接的糖基化。FVIII的糖基化在细胞内折叠和运输中起作用。硫酸化对于与不同蛋白，尤其是凝血酶和血管性血友病因子(vWF)的胞外相互作用非常重要。其发生在酸性区a1、a2和a3的六个酪氨酸上。丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶的细胞内切割将FVIII分成重链(A1-a1-A2-a2-B)和轻链(a3-A3-C1-C2)。在这一切割过程中，部分B结构域可能会丢失。因而，轻链的分子量为80kDa，而重链可能略有异质性，其分子量在210kDa左右。重链与轻链之间的结合不是共价的，而是由A1和A3域之间的二价金属离子Cu2+介导的。在循环中，FVIII通过a3、C1和C2结构域与vWF结合，从而保护FVIII免于早期激活和降解。激活后，FVIII在三个位置被凝血酶切割，导致产生异源三聚体和B结构域的丢失(异源三聚体FVIIIa)。异源三聚体与被激活的凝血因子IXa和凝血因子X形成复合物，并且轻链与磷脂双层结合，例如(被激活的)血小板的细胞膜。甲型血友病主要是X染色体连锁的遗传性出血性疾病，在5000名新生男性中有1名发生。然而，由于针对FVIII的自身免疫应答，因而甲型血友病也可能自发发生。甲型血友病患者遭受更长的出血持续时间、自发性出血和内出血，影响其日常生活。通常通过施用FVIII治疗甲型血友病患者。根据疾病的严重程度(轻度、中度或重度)，根据需要进行治疗或预防。治疗性FVIII产品是从人血浆中纯化的(pFVIII)，或者该产品是在细胞培养物中重组生产的(rFVIII)。在开发用于治疗的重组FVIII分子的过程中，已经设计了B结构域缺失的FVIII分子，因为B结构域对于凝血中FVIII的功能并不重要。这主要导致尺寸减小。最常见的B结构域缺失的FVIII产品之一是辉瑞公司生产的ReFacto或ReFactoAF。这种FVIII变体缺乏B结构域的894个氨基酸。关于FVIII置换疗法的一个问题是该蛋白质的体内半衰期相对较短。已尝试增加所述半衰期，例如在WO2015/023894A1中。该文献提供了重组FVIII蛋白，其中至少一个许可环或a3结构域中的一个或多个氨基酸被置换或缺失，或被异源性部分替代，同时保留促凝血FVIII活性。所产生的FVIII蛋白应该具有例如增加的体内稳定性。多达30％的患有严重甲型血友病的患者会产生针对治疗性FVIII的抑制性抗FVIII抗体。这是由于以下事实：这些患者的免疫系统将所应用的治疗性FVIII识别为外源性，因为患者产生改变的内源性FVIII变体(可以被突变或截短)，或者根本没有FVIII。已知针对FVIII的抑制性抗体经历了类别转换和亲和性成熟。这提示分泌抗体的B细胞的T细胞依赖性激活。这种T细胞依赖性B细胞激活需要激活的辅助性T细胞，所述辅助性T细胞是通过与抗原提呈细胞(APC)相互作用从初始(naive)辅助性T细胞衍生而来的，所述抗原提呈细胞呈递FVIII抗原和其他共刺激。至少一些血友病患者可以将FVIII的完整人类序列(作为治疗剂施用)视为外源蛋白质，因为尚未发展出对该蛋白的中央耐受性。根据受试者的HLA，给药频率以及每个受试者FVIII中存在的突变的位置和性质，可以通过FVIII治疗诱导对FVIII的免疫应答。将那些干扰FVIII功能的针对FVIII的那些抗体称为抑制性抗体或抑制剂。过去，接受FVIII治疗的受试者中FVIII抑制剂的开发与FVIII的更严重的突变或不表达相关。可以预期，替代疗法越“外源“，则所产生的免疫应答就越强大。事实上，在血友病患者中，抗治疗性免疫应答可以是治疗性FVIII和健康的功能性免疫系统之间相互作用的正常和预期的结果。在形成抑制剂的情况下，患者大多接受免疫耐受诱导(ITI)疗法。在可能需要数周、数月或数年的该治疗期间，将非常高剂量的FVIII应用于患者，以耗尽免疫系统并相应地诱导耐受性。对于患者及其护理者而言，这种疗法非常昂贵并且费力。在ITI期间，每天应用FVIII，在一些情况下甚至一天两次。除了治疗剧烈以外，当存在抑制剂时出血数量也会增加。保护患者免于因关节出血而导致残疾的目的损害了患者以及整个家庭的社会生活。此外，在很大比例的患者中，ITI并不成功。重组猪FVIII被FDA批准用于治疗已对人FVIII已产生自身免疫应答的甲型血友病患者。WO99/46274A1公开了具有人和动物FVIII序列或人FVIII和非FVIII序列的杂交FVIII，包括修饰的因子VIII，其中氨基酸序列通过一个或多个特定基因座的置换而改变，其中因子VIII不受针对A2或C2结构域表位的抑制性抗体的抑制。WO2016/123200A1还描述了重组或嵌合FVIII蛋白，其中一个或多个蛋白结构域包含衍生自祖先重构的氨基酸序列的氨基酸序列，其中所得的FVIII显示出抑制剂结合降低，即其中B细胞表位已缺失。由于认为T细胞参与了针对FVIII的高亲和性抗体的产生，因而建议开发不含常见T细胞表位并因此在患者中不诱导免疫应答的重组FVIII分子(Scott，2014,Haemophilia20(01):80-86；Tangri等人，2005，JImmunol.174：3187-3196)。Moise等人(2012，ClinImmunol142(3)：329-331)公开了去免疫化FVIII肽，其中已通过计算机途径鉴定了C2结构域T细胞表位并对其进行修饰。已在HLA结合测定中对修饰的肽进行了评价，并用于免疫小鼠。Schubert等(2018,PLoSComputBiol14(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组因子VIII蛋白，其在选自以下的位置包含至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、I632、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、S2125、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335；/n其中N的置换独立地选自以下：D、H、S和E；其中I的置换独立地选自以下：T和V；其中S的置换独立地选自以下：A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自以下：N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自以下：A和T；其中Y的置换独立地选自以下：N、H和S；其中F的置换独立地选自以下：H和S；其中K的置换独立地选自以下：N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自以下：Q、H和S；其中M的置换选自以下：R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自以下：R、D、E、H和K；/n其中所述位置是相对于SEQ ID NO:1所示的全长人因子VIII分子而指定的；/n和其中与由SEQ ID NO:2组成的因子VIII蛋白相比，如在显色测定中所确定的，所述重组因子VIII蛋白保留了至少50％的凝血活性，/n或者所述重组因子VIII蛋白的融合蛋白。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180412 EP 18166982.11.一种重组因子VIII蛋白，其在选自以下的位置包含至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、I632、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、S2125、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335；
其中N的置换独立地选自以下：D、H、S和E；其中I的置换独立地选自以下：T和V；其中S的置换独立地选自以下：A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自以下：N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自以下：A和T；其中Y的置换独立地选自以下：N、H和S；其中F的置换独立地选自以下：H和S；其中K的置换独立地选自以下：N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自以下：Q、H和S；其中M的置换选自以下：R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自以下：R、D、E、H和K；
其中所述位置是相对于SEQIDNO:1所示的全长人因子VIII分子而指定的；
和其中与由SEQIDNO:2组成的因子VIII蛋白相比，如在显色测定中所确定的，所述重组因子VIII蛋白保留了至少50％的凝血活性，
或者所述重组因子VIII蛋白的融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的重组因子VIII蛋白，其中所述氨基酸置换选自以下：Y748S、L171Q、S507E、N79S、I80T、I105V、S112T、L160S、V184A、N233D、L235F、V257A、I265T、N299D、Y426H、Y430H、L505N、F555H、I610T、N616E、I632T、L706N、N754D、K1837E、R1936Q、S2030A、S2037G、N2038D、S2077G、M2123K、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、V2313A、S2315T、V2333A和Q2335H。


3.根据前述任一项权利要求所述的重组因子VIII蛋白，其中所述重组因子VIII蛋白包含所述置换中的3-25个和所述置换位于不同的免疫原性簇内。


4.根据前述任一项权利要求所述的重组因子VIII蛋白，其在选自以下的位置包含至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、S112、L160、V184、N233、I265、N299、Y426、F555、N616、I632、L706、K1837、R1936、N2038、S2077、S2125、F2215、K2226、K2258、S2315和V2333；
其中所述至少三个氨基酸置换优选地选自以下：Y748S、L171Q、S507E、N79S、S112T、L160S、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、F555H、N616E、I632T、L706N、K1837E、R1936Q、N2038D、S2077G、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、S2315T和V2333A。


5.根据前述任一项权利要求所述的重组因子VIII蛋白，其至少在以下位置包含氨基酸置换：
a.N79S、S112T、N233D和I265T；和/或
b.N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D和I265T；和/或
c.N299D、Y426H和S507E；和/或
d.F555H、N616E、L706N、Y748S；和/或
e.F555H、N616E、I632T、L706N和Y748S；和/或
f.S2077G、S2315T和V2333A；和/或
g.N2038D、S2077G、S2315T和V2333A；和/或
h.S2077G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
i.N2038D、S2077G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
j.N2038D、S2077G、S2125G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
k.L171Q、S507E、Y748S和V2333A；和/或
l.L171Q、N299D、N616E和V2333A；和/或
m.S112T、S507E、Y748S、K1837E和N2038D；和/或
n.S112T、Y426H、N754D、K1837E和N2038D
优选地，至少将b和c下指定的置换组合，任选地还包含选自d或e和/或f、g、h、I或j下指定的那些和/或K1837E的置换。


6.根据前述任一项权利要求所述的重组因子VIII蛋白，其至少在以下位置包含氨基酸置换：N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706和Y748，其中优选地所述置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N和Y748S，其中任选地，所述蛋白还包含K1837E并包含根据SEQIDNO:7的aa20-1533的氨基酸序列。


7.根据前述任一项权利要求所述的重组因子VIII蛋白，其至少在以下位置包含氨基酸置换：N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706、Y748、N2038、S2077、S2315和V2333，其中优选地18个置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F5...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·温特林，S·基斯特纳，J·道芬巴赫，A·德格鲁特，W·马丁，C·昂格雷尔，
申请(专利权)人：生物测试股份公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE