具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体制造技术

具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体，及其制备方法。所述凝乳酶变体在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或更多个位置处产生改变，其中所述改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，所述至少一个氨基酸位置对应于以下任意位置：77；154；156；212；224；256和367。所述凝乳酶变体具有提供更高C/P比的凝乳酶活性。

【技术实现步骤摘要】
具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体本申请是申请日为2015年2月26日、申请人为科.汉森有限公司、专利技术名称为“具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体”的中国专利申请201580009539.6的分案申请。
本专利技术涉及具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体。
技术介绍
通过乳凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶)的酶促乳凝固是乳酪生产中的最重要工艺之一。酶促乳凝固是一个两阶段工艺：第一阶段，其中蛋白水解酶凝乳酶或胃蛋白酶攻击κ-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态；第二阶段，其中乳随后凝固并形成凝块。凝乳酶(EC3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC3.4.23.1)(哺乳动物胃中的乳凝固酶)是属于肽酶中的一大类的天冬氨酸蛋白酶。当在胃黏膜细胞中产生时，凝乳酶和胃蛋白酶分别作为无酶活性的前凝乳酶原(pre-prochymosin)和前胃蛋白酶原存在。当分泌凝乳酶时，N端肽片段，即前片段(pre-fragment)(信号肽)被切除以产生包含原片段(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是该酶的基本无活性形式酶，但是其在酸性条件下通过原片段的自动催化性去除被活化而变成活性凝乳酶。这种活化在适宜的pH条件下在胃腔中体内发生或者在酸性条件下体外发生。牛(Bostaurus)前凝乳酶原、凝乳酶原和凝乳酶的结构和功能特征已得到广泛研究。牛前凝乳酶原分子的前部分包含16个aa残基并且对应凝乳酶原的原部分的长度是42个aa残基。活性牛凝乳酶包含323个aa，是两种皆具有活性的形式A和B的混合物。凝乳酶在哺乳动物物种中天然产生，所述哺乳动物例如牛、骆驼、山羊、水牛、绵羊、猪、人、猴和大鼠。牛凝乳酶已商用于乳品工业多年。WO02/36752A2(Chr.Hansen))描述了骆驼凝乳酶的重组产生。WO2013/174840A1(Chr.Hansen)描述了牛和骆驼凝乳酶的突变体/变体。WO2013/164479A2(DSM)描述了牛凝乳酶的突变体。下文紧接着列出的参考文献在本专利技术的上下文中可看作描述凝乳酶突变体的参考文献：-Suzuki等：SitedirectedmutagenesisrevealsfunctionalcontributionofThr218,Lys220andAsp304inchymosin,ProteinEngineering,第4卷,1990年1月,第69-71页；-Suzuki等:Alterationofcatalyticpropertiesofchymosinbysite-directedmutagenesis,ProteinEngineering,第2卷,1989年5月,第563-569页；-vandenBrink等：Increasedproductionofchymosinbyglycosylation,Journalofbiotechnology,第125卷,2006年9月,第304-310页；-Pitts等：ExpressionandcharacterisationofchymosinpHoptimamutantsproducedinTricodermareesei,Journalofbiotechnology,第28卷,1993年3月,第69-83页；-M.G.Williams等：Mutagenesis,biochemicalcharacterizationandX-raystructuralanalysisofpointmutantsofbovinechymosin,Proteinengineeringdesignandselection,第10卷,1997年9月,第991-997页；-Strop等：Engineeringenzymesubsitespecificity:preparation,kineticcharacterization,andx-rayanalysisat2.0ANGresolutionofVal111phesitemutatedcalfchymosin,Biochemistry,第29卷,1990年10月,第9863-9871页；-Supannee等：Site-specificmutationsofcalfchymosinBwhichinfluencemilk-clottingactivity,FoodChemistry,第62卷1998年6月,第133-139页；-Zhang等：Functionalimplicationsofdisulfidebond,Cys45-Cys50,inrecombinantprochymosin,Biochimicaetbiophysicaacta,第1343卷,1997年12月,第278-286页。上文提及的现有技术参考文献均未直接且明确地描述下文中所述/要求保护的任一凝乳酶突变体/变体。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体。如本文的工作实施例中所讨论的——本专利技术人已鉴定出多种经改进的骆驼(参见本文中实施例6)和牛/骆驼(参见本文中实施例7)凝乳酶变体。基于对该骆驼和牛变体的比较分析——本专利技术人鉴定出多个另外的就以下方面而言在本文中具有重要意义的氨基酸位置：通过制备这些位置中一个或多个的变体可得到经改进的凝乳酶变体。如本领域中已知的——从不同哺乳动物种(例如，如牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠)获得的不同天然野生型凝乳酶多肽序列具有相对高的序列相似性/同一性。在本文的图1中，这通过对本文中相关的不同凝乳酶序列进行比对来例示。鉴于这一相对密切的序列关系—认为不同的天然野生型凝乳酶的3D结构也是相对类似的。在本专利技术的上下文中—天然获得的野生型凝乳酶(例如牛凝乳酶或骆驼凝乳酶)在本文中可以是亲本多肽的一个实例——即对其进行改变以产生本专利技术的变体凝乳酶多肽的亲本多肽。不受理论的限制—认为本文中所讨论的凝乳酶相关的氨基酸位置就以下方面而言在本文中任意相关的目的凝乳酶(例如，例如牛、骆驼、绵羊、猪、大鼠等的凝乳酶)中具有普遍重要性—通过制备这些位置中一个或多个的变体一般可得到经改进的凝乳酶变体(例如，经改进的牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠凝乳酶变体)。如本文所讨论的—作为确定目的亲本凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置的参照序列，本文中使用公知的牛凝乳酶B前凝乳酶原序列(Genbank登录号P00794—在本文中公开为SEQIDNO:1)。SEQIDNO:1的牛凝乳酶B前凝乳酶原在本文中可另称为牛(Bosbovis)凝乳酶B或者简称为牛凝乳酶。该序列也示出在本文的图1中。本文中相关的另一凝乳酶序列是公知的本文中SEQIDNO:2的单峰驼(Cameliusdromedarius)凝乳酶序列。其在本文中可另称为骆驼凝乳酶。该序列也示于本文的图1中。在本专利技术上下文中，认为与SEQIDNO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少65％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其包括以下步骤：/n(a)：在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或更多个位置处产生改变，其中所述改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，所述至少一个氨基酸位置对应于以下任意位置：77；154；156；212；224；256和367；以及/n(b)：生产并分离步骤(a)的经改变多肽，从而获得所述分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体具有凝乳酶活性；/n并且其中：/n(i)：所述亲本多肽的氨基酸位置是通过所述亲本多肽与SEQ ID NO:1的多肽的比对来确定的—即SEQ ID NO:1的多肽被用来确定所述亲本多肽的对应氨基酸序列；且/n(ii)：所述亲本多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％序列同一性，所述成熟多肽为SEQ ID NO:1的第59位氨基酸至第381位氨基酸；/n并且其中所述分离的凝乳酶多肽变体具有：/n-与包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活性；和/n-与包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活性。/n

【技术特征摘要】
20140226 EP 14156707.3;20140711 EP 14176664.21.一种用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其包括以下步骤：
(a)：在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或更多个位置处产生改变，其中所述改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，所述至少一个氨基酸位置对应于以下任意位置：77；154；156；212；224；256和367；以及
(b)：生产并分离步骤(a)的经改变多肽，从而获得所述分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体具有凝乳酶活性；
并且其中：
(i)：所述亲本多肽的氨基酸位置是通过所述亲本多肽与SEQIDNO:1的多肽的比对来确定的—即SEQIDNO:1的多肽被用来确定所述亲本多肽的对应氨基酸序列；且
(ii)：所述亲本多肽与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少65％序列同一性，所述成熟多肽为SEQIDNO:1的第59位氨基酸至第381位氨基酸；
并且其中所述分离的凝乳酶多肽变体具有：
-与包含SEQIDNO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活性；和
-与包含SEQIDNO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活性。


2.如权利要求1所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，并且其中所述替换是K77T；I154L；D156V；S212A；L224V；V256I或V367I。


3.如权利要求1或2所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，并且其中所述替换是：
L280I+G309D+L224V+E320T+T235S；
L280I+G309W+K77T+R324I；
L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q；
L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L；
L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L；
L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S；
L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
L280I+G309W+S212A+V261A；
L280I+G309D+V256I+V90L+E141S；
L280I+G309D+K120Q+Y326F+K77T；
L280I+G309D+I154L+T235S+K379P；
L280I+G309D+M223E+L224V+L273V；
L280I+G309D+S222G+R324V+I154L；
L280I+G309D+K120Q+V367I或
D117N+H134Q+M223E+L224V+V256I+L280I。


4.如前述权利要求中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述亲本多肽与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少95％序列同一性。


5.如权利要求1至4中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述亲本多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少95％序列同一性，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸。


6.一种分离的凝乳酶多肽变体，其是通过权利要求1至5中任一项所述的方法获得的。


7.一种分离的凝乳酶多肽变体：
(a)：其在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置处包含改变，其中所述改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，所述至少一个氨基酸位置对应于以下任何位置：77；154；156；212；224；256和367；且
(b)：其中所述变体具有凝乳酶活性；
并且其中：
(i)：所述亲本多肽的氨基酸位置是通过所述亲本多肽与SEQIDNO:1的多肽的比对来确定的—即，SEQIDNO:1的多肽被用来确定所述亲本多肽的对应氨基酸序列；且
(ii)：所述亲本多肽与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少90％序列同一性，所述成熟多肽为SEQIDNO:1的第59位氨基酸至到第381位氨基酸；且
(iii)：所述分离的变体多肽与SEQIDNO:1的成熟多肽具有小于100％序列同一性；
并且
其中所述分离的变体具有与包含SEQIDNO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活性。


8.如权利要求7所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述亲本多肽与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少97％序列同一性；并且
其中所述分离的牛凝乳酶变体与SEQIDNO:1的成熟多肽相比包含少于10个氨基酸改变(例如替换)。


9.如权利要求7至8中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰尼斯·马腾·范丹尼布林克，J·L·詹森，J·雅各布森，马丁·伦德，伊本·杰普森，C·杰克尔，
申请(专利权)人：科·汉森有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK