一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法技术

本申请公开了一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，属于酶分离纯化技术领域。分离纯化方法为：从猪胰中提取粗胰酶，向600‑700份水中加入1‑2份冰醋酸，再加入20‑30份粗胰酶和20‑30份聚乙二醇，在10‑20℃条件下静置12‑16h；板框压滤静置后的混合液获得清液；将清液上样至阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠洗脱；将洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，静置分相；取分相后的有机相加入等体积的反萃取水相，漩涡混合，静置分相；取分相后的水相加入稳定剂冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。本申请获得的胰激肽原酶具有较高的酶活力和纯度，且分离纯化方法操作简单，原料成本低廉，特别适合工业大生产。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法
本申请涉及酶分离纯化
，特别涉及一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法。
技术介绍
胰激肽原酶也称胰激肽释放酶，是丝氨酸蛋白酶家族的一员,但和典型丝氨酸蛋白酶不同的是其专一性较强,对酪蛋白、血红蛋白等常见蛋白质底物几乎不起作用,而专一的作用于蛋白质底物激肽原而释出激肽。激肽释放酶分为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。组织激肽释放酶是一种单链的酸性糖蛋白,平均分子量范围是25-45KD，等电点为4.05。组织激肽释放酶最初的形式是激肽释放酶原,它以激肽释放酶原的形式在组织中合成,然后被释放到组织液中,经过胰蛋白酶、内毒素激活就形成了活性的激肽释放酶。激活的组织激肽释放酶作用于低分子量的组织激肽原,生成活性产物胰激肽,也称血管舒缓素或赖氨酸缓激肽,后者可以进入组织毛细血管,经过毛细血管中的氨基肽酶水解去掉赖氨酸后就形成了活性更强的缓激肽从而发挥作用。所以，组织激肽释放酶可以使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加,使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加,适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症,对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有作用。同时，激肽释放酶通过与其它血管活性物质相互作用,参与肾脏功能调节,降低血压,促进电解质和葡萄糖的转运。激肽释放酶也可以作为活化因子,使纤溶酶原激活成纤溶酶,将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽,从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用,并用于治疗血栓、预防血栓再形成。目前临床用药主要是从组织中提取激肽释放酶，组织激肽释放酶以猪胰激肽释放酶为主。猪胰激肽释放酶纯化技术研究已有近30年的历史，主要以猪胰脏的丙酮粉或胰酶为原料提取激肽释放酶。纯化方法主要有有机溶剂分级沉淀法、离子交换层析法和亲和层析法。有机溶剂沉淀法对酶蛋白有破坏作用,所得产品比活较低。而亲和层析法虽然可以制备高纯度的激肽释放酶,但操作容积小,成本较高不适用于工业化生产。离子交换法虽然能够制备活性较高的酶蛋白且符合工业化生产，但是不论采用哪种介质,想要制备高纯度的激肽释放酶需要经过多次的层析，操作繁琐,步骤繁多，胰脏资源的利用率低，导致生产成本增高。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本申请的目的是提供一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，以获得一条工艺简单、成本低、提取效率高的胰激肽原酶纯化路线，使用该纯化方法可以获得符合药品质量标准的高纯度胰激肽原酶。本申请的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：a.从猪胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃条件下静置12-16h；b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，采用pH5.10.5M的乙酸钠进行洗脱；d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合1-5min，静置分相；e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1-5min，静置分相；f.取步骤e中静置后的水相，加入0.01-0.1份稳定剂，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。通过采用上述技术方案，本申请首先采用冰醋酸对胰激肽原酶进行提取，并在醋酸溶液中加入聚乙二醇，聚乙二醇的加入起到了保护剂的作用，可以提高胰激肽原酶的活性和稳定性，防止胰激肽原酶的降解；然后采用板框压滤获得含有胰激肽原酶的清液，板框压滤比离心分离的效率高，处理的时间短，充分的保证了胰激肽原酶的酶活，且板框压滤特别适宜工业化生产，提高单次处理量，降低了生产成本；将板框压滤后获得的清液进行阴离子交换层析，阴离子交换层析对胰激肽原酶具有很好的纯化效果，纯化倍数和活性回收率佳；将阴离子交换层析后获得的酶液进行反胶束萃取，反胶束是溶解在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚集体，反胶束萃取操作时间短，胶束内的蛋白质不易变性，样品处理量大，可连续操作，而且反胶束系统可以重复利用,降低了生产成本，特别适合工业生产。反胶束通过酶蛋白表面与表面活性剂极性头之间的静电相互作用溶解酶蛋白,增溶了酶蛋白的反胶束扩散进入有机相中,再将其提取至另一水相,从而实现酶蛋白的相转移,达到分离和提纯的目的。通过调整水相条件及表面活性剂浓度,对反胶束与酶蛋白的相互作用加以控制,可调节酶蛋白高选择性的萃取和反萃取；最后将反胶束萃取获得的胰激肽原酶进行冷冻干燥获得高纯度胰激肽原酶。通过本申请方法纯化获得的胰激肽原酶具有较高的纯度和酶活力以及良好的稳定性，符合药典和卫生部标准，能够满足制备激肽原酶片剂和注射剂的要求。而且本申请分离纯化方法操作步骤简单，原料成本低廉，特别适合工业大生产。优选的，步骤a中，粗胰酶的制备方法包括以下步骤：Ⅰ.在0-4℃条件下，将新鲜猪胰或冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状；Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于0-4℃放置6-12h；Ⅲ.加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，搅拌10-20min，0-4℃条件下3000-5000r/min离心3-8min，收集沉淀；Ⅵ.向沉淀中加入胰脏重量1-2倍的预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。通过采用上述技术方案，本申请采用新鲜猪胰或冷冻猪胰脏作为初始原料，其资源丰富，且其内富含大量的胰激肽原酶，特别适合胰激肽原酶的提取。将新鲜猪胰或冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状后，胰脏中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶以酶原形式存在在浆液中，因此需要采用多种激活剂在适当条件下对其激活；保护剂的加入可以保证酶蛋白的活性和稳定性，保证后续提取工艺的进行。本申请采用低浓度乙醇对胰酶进行溶解，并采用壳聚糖进行沉淀，壳聚糖作为胰酶的沉淀剂，不仅来源丰富，而且沉淀效率高，用量少，无毒，使用安全，最重要的是壳聚糖对沉淀胰激肽原酶具有较好的专一性,使与胰激肽原酶共同沉淀的杂质较少。最后将壳聚糖沉淀后的胰激肽原酶置于循环脱脂机器中加入丙酮脱脂，获得粗胰酶。本申请粗胰酶的提取方法简单，提取率高，且提取获得的粗胰酶活性和稳定性都有保证，为后续胰激肽原酶的分离纯化奠定了基础。优选的，步骤Ⅱ中，所述激活剂为CaCl2和十二指肠中的一种或两种；所述激活剂的加入量为胰浆质量的0.2%-0.5%。通过采用上述技术方案，本申请选用CaCl2和十二指肠中的一种或两种作为激活剂并选定加入量。CaCl2为最常用的激活剂，对胰酶有激活作用,并且能保护胰酶的活性。十二指肠中含有大量的胰蛋白酶，胰蛋白酶可以对酶原起到激活作用，而且，本申请将猪的十二指肠作为激活剂，其与猪胰具有同源性，可以起到更好的激活作用。优选的，步骤Ⅱ中，所述保护本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：/na.从猪胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃条件下静置12-16h；/nb.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；/nc.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；/nd.向步骤c中获得的洗脱液中加入等体积的反胶束溶液，漩涡混合1-5min，静置分相；/ne.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1-5min，静置分相；/nf.取步骤e中分相后的水相，加入0.01-0.1份稳定剂，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.从猪胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃条件下静置12-16h；
b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；
c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，采用pH5.10.5M的乙酸钠进行洗脱；
d.向步骤c中获得的洗脱液中加入等体积的反胶束溶液，漩涡混合1-5min，静置分相；
e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1-5min，静置分相；
f.取步骤e中分相后的水相，加入0.01-0.1份稳定剂，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。


2.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中，粗胰酶的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ.在0-4℃条件下，将新鲜猪胰或冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状；
Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于0-4℃放置6-12h；
Ⅲ.加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；
Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；
Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，搅拌10-20min，0-4℃条件下3000-5000r/min离心3-8min，收集沉淀；
Ⅵ.向沉淀中加入胰脏重量1-2倍的预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。


3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁啸啸，曹植木，李银海，顾会军，潘胜，朱媛媛，
申请(专利权)人：浙江丰安生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33