一种显著提升斑块消化制备高质量单细胞悬液的方法技术

本发明专利技术公开了一种显著提升单细胞悬液质量的动脉斑块消化的方法，包括胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ、氯化钙、脱氧核糖核酸酶I、磷酸缓冲盐溶液、牛血清白蛋白溶液、RPMI 1640细胞培养液。本发明专利技术同时公开了其在消化斑块组织中的应用前景。本发明专利技术主要针对斑块组织进行消化处理而发明专利技术，通过几种酶的组合，可将斑块组织消化成为活性比例较高单细胞悬液，在单细胞基础上研究斑块组织的生物学反应，从而避免出现存在许多钙化细胞碎片、组织杂质等影响单细胞测序上机或后续数据分析结果的情况。

【技术实现步骤摘要】
一种显著提升斑块消化制备高质量单细胞悬液的方法
本专利技术涉及斑块消化的方法领域，具体涉及斑块组织消化的方法以制备高质量单细胞悬液及其应用。
技术介绍
《中国心血管病报告2018》显示，中国心脑血管疾病患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，心脑血管疾病死亡在居民疾病死亡构成中居首位。目前，心脑血管疾病已成为重大的公共卫生问题，而动脉粥样硬化的控制与心脑血管疾病的防治息息相关。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础，高血压、吸烟和高同型半胱氨酸血症等危险因素均会引起机体产生动脉粥样硬化，甚至由于母体的高胆固醇血症，最早在胎儿主动脉中就能观察到动脉粥样硬化的初级状态“脂质条纹”，动脉粥样硬化的发病机制是多因素的，因此，要实现斑块逆转、延缓发病进程极为复杂。随着科学研究技术的不断更新，尤其在生命科学领域，新的研究方法迭代推陈出新，现在研究过程中需要将动脉斑块组织消化成单细胞悬液，以便通过单细胞测序的方法，分析斑块组织里细胞分类、细胞分群、细胞亚群、细胞表型转换、细胞迁移等，揭示动脉粥样硬化发生发展过程中的时空信息。在单个细胞群体水平上进行分析研究，可以更精准的阐释动脉粥样硬化的发病机理。在处理斑块的过程中，机械法切碎和酶消化若没有处理好，会出现许多细胞碎片及大量死细胞，导致过滤细胞悬液时操作时间过长，以及在后续进行单细胞转录组测序上机的时候会出现管道堵塞的现象，造成精密仪器损坏。虽然现在市面上存有许多组织消化试剂盒，但是由于斑块的特殊性，消化不彻底，存在大量细胞碎片及死细胞，不能达到很好的消化效果，制备的单细胞悬液质量得不到保证。现在斑块组织彻底消化及消除钙化碎片、细胞碎片的问题没有很好的解决。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种显著提升斑块消化制备高质量单细胞悬液的方法，以解决现有技术的不足。本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种酶组合，所述酶组合包含：胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ；优选地，胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ的浓度比例是1：1：1：1；更优选地，所述酶组合包含脱氧核糖核酸酶Ⅰ。本专利技术提供了一种消化液，包含前面所述的酶组合。进一步，所述消化液包含RPMI1640细胞培养液。进一步，所述消化液的酶组合中胶原蛋白酶浓度均为1mg/mL，脱氧核糖核酸I酶浓度为200U/mL。更进一步，所述消化液包含氯化钙。在本专利技术的具体实施方案中，所述消化液中氯化钙终浓度为10mM。本专利技术提供了一种消化颈动脉斑块的方法，所述方法包括使用前面所述的酶组合或使用前面所述的消化液。进一步，所述方法包括如下步骤：(1)收集组织：选取病例样本，斑块手术剥脱离体后，置于4℃MACS组织保存液中；(2)分离样品：将斑块样品，置于PBS中清洗血凝块，剔除钙化块，并分离；(3)组织消化：将样品转移到消化液中，剪碎，进行消化；(4)终止消化：消化1h后，用微型移液枪将消化体系反复吹打混匀，室温静置1min。在200g，4℃，5min条件下离心；(5)过筛离心：消化体系液体离心后，弃去上清液，用15mlPBS重悬，然后过40μm细胞筛；(6)优化处理：红细胞裂解，美天旎去死细胞kit，美天旎去碎片kit等滤除杂质；(7)活性检测：使用Countstar仪器ID:WIN-7RFTLHV6T5L检测。本专利技术提供了前面所述的酶组合在制备前面所述的消化液中的应用。本专利技术提供了前面所述的酶组合或前面所述的消化液在制备消化颈动脉斑块的试剂中的应用。进一步地，所述颈动脉斑块为人颈动脉斑块组织。本专利技术的有益效果：本专利技术方法主要针对斑块组织进行完全消化处理而专利技术，通过几种酶的组合，并结合机械法，可将斑块组织彻底消化成为单细胞悬液，在单个细胞水平研究斑块的病理生理机制，通过各种优化方案处理可将单细胞悬液里的红细胞、细胞碎片、杂质等去掉而不影响单细胞的活性、浓度，从而避免出现钙化细胞碎片、杂质、细胞结团等影响后续单细胞上机测序、测序数据库分析以及后续流式细胞术、细胞培养验证不易的情况。附图说明图1为处理对照组1的斑块组织经细胞活性检测仪器Countstar的检测图片信息；图2为处理对照组2的斑块组织经细胞活性检测仪器Countstar的检测图片信息；图3为处理实验组的斑块组织经细胞活性检测仪器Countstar的检测图片信息；图4为斑块组织消化后细胞活性统计图。具体实施方式下面结合实验组和附图对本专利技术做更进一步地解释。下列实例仅用于说明本专利技术，但并不限定本专利技术的实施范围。实施例斑块组织消化一、实验材料以下实验组和对照组1、对照组2涉及的酶，胶原蛋白水解酶(CollagenaseⅠ，sigma，C0130-100MG)，胶原蛋白水解酶Ⅱ(CollagenaseⅡ，sigma，C6885-100MG)，胶原蛋白水解酶Ⅲ(CollagenaseⅢ，Solarbio，C8490-100mg)，胶原蛋白水解酶Ⅳ(CollagenaseⅣ，sigma，C5138-100MG)，胶原蛋白水解酶Ⅺ(CollagenaseⅪ，sigma，C7657-100MG)，浓度均为1mg/ml。胰蛋白酶(0.25％Trypsin-EDTA(1×)，Gibco-25200072-500ml)，透明质酸酶(Hyaluronidase，sigma，H3506-50MG)。氯化钙(CaCl2，sigma，C1016-500g)。脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ，neb，M0303S)。磷酸缓冲盐溶液(PBS，Hycone，SH30256.01B)。牛血清白蛋白溶液(BSA，美天旎，130-091-376)。1640培养液(RPMI1640，life，11875093)。胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅺ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为1mg/ml。对照组1中，胶原蛋白水解酶Ⅳ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为2mg/ml。对照组2中，胰蛋白酶，胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅱ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为2mg/ml。PBS含1％BSADNaseⅠ酶：用1640细胞培养液溶解至终浓度为200U/ml。二、步骤实验前准备，将灭菌消毒的实验器械，耗材等置入超净台中，紫外线照射1小时，并在超净台中将实验所需的酶配置好，制成斑块消化的混合酶体系，内含：胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅺ(各1mg/ml)、氯化钙(10mM)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(200U/ml)。并分装0.5ml混合酶到2ml的EP管中。1.取材：获取病人颈动脉斑块剥脱手术离体时的颈动脉斑块组织标本，于MACS组织保存液(MACSTissueStorageSolution，货号：130-100-008)中置于4℃保存运送处理。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶组合，其特征在于，所述酶组合包含：胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ；/n优选地，胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ的浓度比例是1：1：1：1；/n更优选地，所述酶组合包含脱氧核糖核酸酶Ⅰ。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶组合，其特征在于，所述酶组合包含：胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ；
优选地，胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ的浓度比例是1：1：1：1；
更优选地，所述酶组合包含脱氧核糖核酸酶Ⅰ。


2.一种消化液，包含权利要求1所述的酶组合。


3.根据权利要求2所述的消化液，其特征在于，所述消化液包含RPMI1640细胞培养液。


4.根据权利要求3所述的消化液，其特征在于，所述消化液的酶组合中胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅺ浓度均为1mg/mL，脱氧核糖核酸酶I浓度为200U/mL。


5.根据权利要求4所述的消化液，其特征在于，所述消化液包含氯化钙。


6.根据权利要求4所述的消化液，其特征在于，所述消化液中氯化钙终浓度为10mM。


7.一种消化颈动脉斑块的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的酶组合或使用权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱尚明，吉训明，张永彪，石小峰，成军，裴葆青，谷涌泉，刘会生，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：北京;11