年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用制造技术

年轻人血源APPα‑分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，涉及人血液制品生物制药领域，正常年轻人的年龄>18岁、<35岁的血清、血浆淀粉样前体蛋白即amyloid precursor protein简称为APP特异性α‑分泌酶样活性组分即APP419Y™的分离、纯化和制备方法，以及在预防和治疗老年神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病即Alzheimer's Disease简称为AD和帕金森病即Parkinson's disease简称为PD的应用；本发明专利技术确认了αCBSF是特异性并剂量依赖性地对大脑型fAPP695蛋白的α‑分泌酶切，更重要显示αCBSF不会裂解前体促炎细胞因子，包括IL‑6、TNFα以及与肿瘤生长相关的前体因子，亦不会引起病理性炎症反应以及肿瘤的发生发展，最终证实了αCBSF通过多靶点分子生物学机制减轻和改善AD小鼠AD病理改变和行为障碍。

【技术实现步骤摘要】
年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用
本专利技术涉及人血液制品生物制药领域，尤其是涉及年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用。
技术介绍
公知的，阿尔茨海默病（Alzheimer'sDisease，AD）又称老年痴呆病，是一种中枢神经系统渐进性发展的退行性病变，主要表现为患者渐进性的记忆障碍、认知障碍、语言障碍、人格失控等行为症状，俗称“老小孩”、“活死人”，严重影响患者的生活与社交功能，严重影响患者及至亲的生活质量。AD的病因及发病机制尚未明了，特征性病理改变为β-淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及小胶质细胞增生性神经炎和神经元丢失。AD的具体病因尚不清楚，较为公认的为AD患者中细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)大量沉积，形成细胞外淀粉样老年斑和细胞内tau蛋白过度磷酸化，进而形成神经纤维缠结Neurofibrillarytangles,NFT），这些主要的病理改变目前仍然是AD神经病理学诊断的标准，但相关的发病机制依然不清楚，针对AD尚无有效的防治手段，Aβ可由细胞膜上I型跨膜淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）经β-分泌酶（BACE）和γ-分泌酶水解产生，Aβ过度产生后形成的细胞外淀粉样老年斑与NFT形成神经元细胞凋亡、炎症及氧化应激反应，进一步引起AD的发生，在正常条件下，90％的淀粉样前体蛋白被α-分泌酶水解，该酶在Aβ序列内进行切割，释放出可溶性APP（sAPPα,secretedAPPalpha）和α-C末端片段（α-CTF，alpha-C-terminalfragment）来避免了Aβ的过度产生，此外，产生的sAPPα可在大脑内发挥许多保护功能，包括神经元保护、神经突触生长及环鸟苷单磷酸酯（guanosinemonophosphate,GMP）的激活，已有研究表明过度APPβ-分泌酶裂解导致患者大脑中sAPPα水平明显降低，并且伴随Aβ增多以及相关的病理改变，最终促进AD的发生发展，因此，增强α-分泌酶活性，抑制APP的β-分泌酶的蛋白裂解过程，减少Aβ的产生，从而进一步抑制老年斑的形成、tau过度磷酸化及神经炎症，可以作为预防和治疗AD的新策略。目前，已知的候选α-分泌酶有：TACE(TNFα转化酶)或ADAM9/10[金属蛋白酶（adisintegrinandmetalloproteinase，ADAM9/10）]，尽管这些酶也具有APP的α-酶切活性，但是同时它们也切割细胞炎症因子或趋化因子的前体蛋白，并引起炎症反应以及进一步引起肿瘤的发生和发展。因此，过度激活它们的活性作为治疗AD的策略，很可能带来严重的不良反应，因此，寻找以及激活APP特异性α-分泌酶作为治疗AD的新靶点是药物研发的重要方向，具有极高的临床应用价值。
技术实现思路
为了克服
技术介绍
中的不足，本专利技术公开了年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，本专利技术通过对年轻人血清、血浆中部分纯化α-分泌酶，确认了αCBSF是特异性并剂量依赖性地对大脑型fAPP695蛋白的α-分泌酶切，αCBSF不会裂解前体促炎细胞因子，包括IL-6、TNFα以及与肿瘤生长相关的前体因子，不会引起病理性炎症反应以及肿瘤的发生发展，最终证实了αCBSF通过多靶点分子生物学机制减轻和改善AD小鼠AD病理改变和行为障碍。年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，包括正常年轻人的年龄>18岁、<35岁的血清、血浆淀粉样前体蛋白即amyloidprecursorprotein简称为APP特异性α-分泌酶样活性组分即APP419Y™的分离、纯化和制备方法，以及在预防和治疗老年神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病即Alzheimer'sDisease简称为AD和帕金森病即Parkinson'sdisease简称为PD的应用；正常年轻人血清（youngbloodsera,YBS）可特异性地促进APP695（fAPP695）在α酶切位点的裂解，但不裂解前体促炎细胞与肿瘤生长前体因子，从YBS中分离纯化、鉴定了具有α-分泌酶活性组分(APP419Y™)，并在分子、细胞以及动物水平证实了APP419Y™为APP特异性的α-分泌酶样活性蛋白，对AD模型小鼠的AD样病理损害和行为障碍均有改善作用。进一步，YBS以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的α-酶切；进一步，YBS直接介导神经元特异性APP695的α-酶切；进一步，使用Econo-Pack10DG色谱柱（0.7-0.9MNaCl）分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性组分；进一步，使用制备级Superdex200色谱柱对蛋白质大小的进行排除；进一步，应用离子交换色谱进一步分离到具有高活性的APP特异性α-分泌酶活性组分。进一步，正常年轻人血清（YBS）以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的α-酶切-用0％-10％YBS、成人血清（ABS）或老年血清（AgBS，>75岁）持续3-5小时，此外，10％热灭活的YBS，在0至5小时之间用5％-15％YBS、ABS或AgBS处理CHO/APPwt细胞3-5小时，收集条件培养基，并进行sAPPαELISA以及使用sAPPα特异性抗体（2B3）的sAPPαWB分析，用YBS在人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）、鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）和过度表达人野生型APP的人类成纤维细胞中重复了以上结果。进一步，YBS直接促进神经元特异性APP695的α-酶切-在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合物（PI，1X），TACE抑制剂（TAPI-0，1µM）或ADAM抑制剂(GM6001，1µM）的情况下，将标记有C端MYC/DDK的人类重组全长APP695（fAPP，OriGen，100ng）与5％YBS，失活YBS、或AgBS一起孵育在37ºC下放置4-6小时，使用sAPPα特异性抗体（2B3）对反应混合物进行sAPPαWB分析，使用6E10（抗Aβ1-17抗体）进行总APP分析，将100ngfAPP与5％YBS孵育1-7和24小时，5％FBS或失活FBS放置15-24小时，然后分别使用2B3和6E10进行sAPPα和总APPWB分析，sAPP770是指YBS或AgBS的内源性α-分泌酶切产物，而sAPP695是指fAPP的α-分泌酶切产物。进一步，分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性的部分-为了纯化并最终鉴定YBS中APP特异性α-分泌酶的活性，最初使用了Econo-Pack血清IgG纯化试剂盒（Bio-Rad），使用Econo-Pack10DG色谱柱对YBS（4mL）进行了脱盐处理，将脱盐的血清上样至DEAEAffi-Gel蓝柱，并根据说明洗脱IgG，然后，用0.1-2.0M的NaCl缓冲液的离子强度梯度洗脱，再收集15-25个蛋白质馏分，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用10μL每种蛋白质组分处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，包括正常年轻人的年龄>18岁、<35岁的血清、血浆淀粉样前体蛋白即amyloid precursor protein简称为APP特异性α-分泌酶样活性组分即APP419Y™的分离、纯化和制备方法，以及在预防和治疗老年神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病即Alzheimer's Disease简称为AD和帕金森病即Parkinson'sdisease简称为PD的应用，正常年轻人血清（young blood sera, YBS）可特异性地促进APP695（fAPP695）在α酶切位点的裂解，但不裂解前体促炎细胞与肿瘤生长前体因子，从YBS中分离纯化、鉴定了具有α-分泌酶活性组分(APP419Y™)，并在分子、细胞以及动物水平证实了APP419Y™为APP特异性的α-分泌酶样活性蛋白，对AD模型小鼠的AD样病理损害和行为障碍均有改善作用，具体步骤如下：/n进一步，YBS以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的 α-酶切；/n进一步，YBS直接介导神经元特异性APP695的α-酶切；/n进一步，使用Econo-Pack 10DG色谱柱（0.7-0.9 M NaCl）分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性组分；/n进一步，使用制备级Superdex 200色谱柱对蛋白质大小的进行排除；/n进一步，应用离子交换色谱进一步分离到具有高活性的APP特异性α-分泌酶活性组分。/n...

【技术特征摘要】
1.年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，包括正常年轻人的年龄>18岁、<35岁的血清、血浆淀粉样前体蛋白即amyloidprecursorprotein简称为APP特异性α-分泌酶样活性组分即APP419Y™的分离、纯化和制备方法，以及在预防和治疗老年神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病即Alzheimer'sDisease简称为AD和帕金森病即Parkinson'sdisease简称为PD的应用，正常年轻人血清（youngbloodsera,YBS）可特异性地促进APP695（fAPP695）在α酶切位点的裂解，但不裂解前体促炎细胞与肿瘤生长前体因子，从YBS中分离纯化、鉴定了具有α-分泌酶活性组分(APP419Y™)，并在分子、细胞以及动物水平证实了APP419Y™为APP特异性的α-分泌酶样活性蛋白，对AD模型小鼠的AD样病理损害和行为障碍均有改善作用，具体步骤如下：
进一步，YBS以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的α-酶切；
进一步，YBS直接介导神经元特异性APP695的α-酶切；
进一步，使用Econo-Pack10DG色谱柱（0.7-0.9MNaCl）分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性组分；
进一步，使用制备级Superdex200色谱柱对蛋白质大小的进行排除；
进一步，应用离子交换色谱进一步分离到具有高活性的APP特异性α-分泌酶活性组分。


2.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的正常年轻人血清（YBS）以时间、剂量和温度依赖性方式促进人野生型APP的α-酶切-用0％-10％YBS、成人血清（ABS）或老年血清（AgBS，>75岁）持续3-5小时，此外，10％热灭活的YBS，在0至5小时之间用5％-15％YBS、ABS或AgBS处理CHO/APPwt细胞3-5小时，收集条件培养基，并进行sAPPαELISA以及使用sAPPα特异性抗体（2B3）的sAPPαWB分析，用YBS在人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）、鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）和过度表达人野生型APP的人类成纤维细胞中重复了以上结果。


3.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的正常年轻人血清（YBS）直接促进神经元特异性APP695的α-酶切-在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合物（PI，1X），TACE抑制剂（TAPI-0，1µM）或ADAM抑制剂(GM6001，1µM）的情况下，将标记有C端MYC/DDK的人类重组全长APP695（fAPP，OriGen，100ng）与5％YBS，失活YBS、或AgBS一起孵育在37ºC下放置4-6小时，使用sAPPα特异性抗体（2B3）对反应混合物进行sAPPαWB分析，使用6E10（抗Aβ1-17抗体）进行总APP分析，将100ngfAPP与5％YBS孵育1-7和24小时，5％FBS或失活FBS放置15-24小时，然后分别使用2B3和6E10进行sAPPα和总APPWB分析，sAPP770是指YBS或AgBS的内源性α-分泌酶切产物，而sAPP695是指fAPP的α-分泌酶切产物。


4.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的分离到具有APP特异性α-分泌酶裂解活性的部分-为了纯化并最终鉴定YBS中APP特异性α-分泌酶的活性，最初使用了Econo-Pack血清IgG纯化试剂盒（Bio-Rad），使用Econo-Pack10DG色谱柱对YBS（4mL）进行了脱盐处理，将脱盐的血清上样至DEAEAffi-Gel蓝柱，并根据说明洗脱IgG，然后，用0.1-2.0M的NaCl缓冲液的离子强度梯度洗脱，再收集15-25个蛋白质馏分，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用10μL每种蛋白质组分处理1-3小时，然后收集条件培养基，并进行sAPPαWB和ELISA分析，分别在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下，加入10μLYBS，脱盐YBS（dYBS）和磷酸盐缓冲盐水（PBS；Ctrl），还从每种经馏分处理的细胞培养物中制备细胞裂解物，作为评估sAPPα产生水平的其他参考，将CHO/APPwt细胞用来自10个不同CBS批次的0.6至1.0MNaCl洗脱馏分处理1-3小时，并收集条件培养基并进行sAPPαELISA，此外，还对每个蛋白质组分进行了SDSPAGE分析，以评估总蛋白质组分。


5.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用，其特征是：所述的制备级Superdex200色谱柱对蛋白质大小的排除-通过分析Superdex200柱，将0.8MNaCl洗脱的YBS蛋白馏分进一步进行大小排除分析，将来自0.8MNaCl洗脱馏分的约100mg蛋白质上样至色谱柱，并用PBS洗脱48馏分，每馏分约0.5mL，在24孔板（2x106/孔）中培养CHO/APPwt细胞，并用40μL每种蛋白质组分处理1-3小时，收集条件培养基，进行sAPPαWB和ELISA分析，以ng/mLsAPPα表示，同时，在与阳性和阴性对照相同的细胞培养条件下分别包括0.8MNaCl洗脱馏分和PBS，洗脱溜分的蛋白质浓度，将CHO/APPwt细胞用由3个独立实验制备的馏分处理，然后收集条件培养基，并进行sAPPαELISA，结果表示为平均值（±S.D.）sAPPα（ng/mg蛋白），0.8MNaCl馏分作为阳性对照，此外，每一大小级分馏都经过SDSPAGE分析，以评估总蛋白分离。


6.根据权利要求1所述的年轻人血源APPα-...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭骏，訾聃，李崧，谢非非，
申请(专利权)人：谭骏，
类型：发明
国别省市：贵州;52