人凝血因子VIIa的纯化方法技术

本发明专利技术提供一种人凝血因子VIIa的纯化方法，采用阴离子交换层析，阴离子交换层析，疏水层析三步纯化，以及灭活病毒和除病毒过滤步骤，制备获得纯度、活性及安全性满足药用要求的人凝血因子VIIa。

【技术实现步骤摘要】
人凝血因子VIIa的纯化方法
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种人凝血因子VIIa的纯化方法。
技术介绍
人凝血因子VII(FVII)是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶，其可以启动外源性凝血途径或通过活化人凝血因子IX而参与内源性凝血途径。FVII在肝脏中合成并分泌到血液中，以分子量大约为50,000Da的单链糖蛋白(酶原)形式在血液中循环。FVII酶原在位点R152-I153处被蛋白酶水解，生成由一个二硫键连接的双链分子，从而转变为活性形式FVIIa。临床研究表明，FVIIa对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的止血具有令人满意的治疗效果。早期的人凝血因子VII制剂以新鲜冰冻血浆为原料，经过硫酸钡吸附并通过多步层析纯化制得，随着DEAE-SephadexA-50凝胶的应用，逐步转变为以A-50凝胶吸附为主，经多步层析纯化制备。由于血浆中人凝血因子VII的含量极低，通常为200～400ng/ml，使得人凝血因子VII的制备非常困难，并且成本极高；同时血浆提取制备工艺复杂，批间差异较大，稳定性较差；另外，以血浆作为原料，大大增加了外源病毒的感染风险。近年来，基因工程技术的发展为FVII的体外重组制备提供了可能。丹麦诺和诺德公司的诺其(NovoSeven)即是通过基因工程技术，将人凝血因子VII的cDNA基因导入BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)中表达生产，并经过活化和高度纯化后获得的具有生物活性的药用重组人凝血因子VIIa。Tomokiyo等人报道了从血浆中制备人凝血因子VIIa的纯化方法(TomokiyoK,YanoH,ImamuraM,etal.Large-scaleproductionandpropertiesofhumanplasma-derivedactivatedFactorVIIconcentrate[J].VoxSanguinis,2010,84(1):54-64.)，具体步骤包括：采用Q-SepharoseFastFlow从血浆中捕获FVII，后采用抗FVII抗体的免疫亲和层析，除病毒过滤后采用DEAE-Sepharose进行纯化，获得FVII-FVIIa混合物，然后通过溶液内激活的方法获得FVIIa。最后通过透析、制剂灌装、冻干等步骤获得FVIIa制剂。Jurlander等人披露了诺和诺德公司的FVIIa的下游纯化工艺(JurlanderB,ThimL,KlausenNK,etal.RecombinantActivatedFactorVII(rFVIIa):Characterization,Manufacturing,andClinicalDevelopment[J].SeminarsinThrombosisandHemostasis,2001,27(4):373-384.)：细胞培养液收获后进行第一步阴离子交换层析捕获FVII，后进行病毒灭活、免疫亲和层析后再进行两步阴离子交换层析以产生完全活化的FVIIa。CN1121723A披露了在纯化层析过程中加入Zn2+对FVII进行可控的活化和降解，层析步骤为：阴离子交换，免疫亲和，阴离子交换，阴离子交换。CN101268185A披露了在纯化过程中加入疏水层析工艺控制药物中的产品相关杂质，如在后洗脱峰中含有的不同水平的N-连接糖基化的糖变体、氧化形式、蛋白水解降解形式(重链切割形式)以及聚集体等。现有的人凝血因子FVIIa的下游纯化技术通常加入亲和层析步骤，通过连接有FVIIa抗体的层析介质来特异性地捕获FVIIa蛋白，但该技术具有以下缺点：①产业化成本高，②免疫亲和层析配基的脱落会造成相关的安全风险。
技术实现思路
本专利技术的目的至少在于提供一种改善的人凝血因子VIIa纯化工艺。在一些方案中，本专利技术提供一种人凝血因子VIIa的纯化方法，其包含以下步骤：阴离子交换层析，阴离子交换层析，疏水层析。在一些方案中，本专利技术提供一种人凝血因子VIIa的纯化方法，其包含以下步骤：阴离子交换层析，阴离子交换层析，疏水层析，并且各步骤依次进行。在一些方案中，本专利技术提供一种人凝血因子VIIa的纯化方法，包括依次进行的以下步骤：1)阴离子交换层析；2)灭活病毒；3)阴离子交换层析；4)疏水层析；5)除病毒过滤；6)超滤换液；7)除菌过滤获得原液。在一些方案中，本专利技术提供一种人凝血因子VIIa的纯化方法，包括依次进行的以下步骤：1)阴离子交换层析；2)对步骤1)所得产物进行病毒灭活；3)采用阴离子交换层析进一步纯化步骤2)所得产物；4)采用疏水层析进一步纯化步骤3)所得产物；5)对步骤4)所得产物进行除病毒过滤；6)对步骤5)所得产物进行超滤换液；7)对步骤6)所得产物进行除菌过滤获得原液。在一些方案中，本专利技术首先采用阴离子交换层析从细胞收获液中捕获目的蛋白，其中该阴离子交换层析可选地包括(a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换材料，(b)用淋洗缓冲液淋洗阴离子交换材料，和(c)用洗脱缓冲液洗脱阴离子交换材料，其中平衡缓冲液的pH为6-10，优选pH为约8，且包含浓度至少为约50mM的氯化钠，优选氯化钠浓度为约50mM；淋洗缓冲液pH为6-10，优选pH为约8，可选地包含浓度至少为约50mM的氯化钠；洗脱缓冲液pH为6-10，优选pH为约8，且包含浓度为50-800mM的氯化钠，优选氯化钠浓度为约500mM。在一些方面，本专利技术的第一步阴离子交换层析包括用平衡缓冲液平衡阴离子交换材料和用洗脱缓冲液洗脱阴离子交换材料，其中平衡缓冲液的pH为6-10，优选pH为约8，且包含浓度至少为约50mM的氯化钠，优选氯化钠浓度为约50mM；洗脱缓冲液pH为6-10，优选pH为约8，且包含浓度为50-800mM的氯化钠，优选氯化钠浓度为约500mM。在一些方面，本专利技术的第一步阴离子交换层析包括用平衡缓冲液平衡阴离子交换材料和用洗脱缓冲液洗脱阴离子交换材料，其中，平衡缓冲液和洗脱缓冲液可分别独立地选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液，优选平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为磷酸盐缓冲液，最优选平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别包括约20mmol/L的磷酸盐。在一些方案中，对第一步阴离子交换层析得到的洗脱液进行灭活病毒是采用S/D(表面活性剂/清洁剂)方法进行。在一些方案中，对病毒灭活后的产物进行第二次阴离子交换层析，以去除Gla(γ-羧基谷氨酸)缺失/部分缺失变体以及其它相关杂质，其中，该步阴离子交换层析可选地包括(a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换材料，(b)用淋洗缓冲液淋洗阴离子交换材料，和(c)用洗脱缓冲液洗脱阴离子交换材料，其中平衡缓冲液的pH为6-10，优选pH为约8，且包含浓度至少为约50mM的氯化钠，优选包含约100mM的氯化钠；淋洗缓冲液pH为6-10，优选pH为约8，且包含浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人凝血因子VIIa的纯化方法，包括依次进行的以下步骤：/n1)阴离子交换层析；/n2)灭活病毒；/n3)阴离子交换层析；/n4)疏水层析；/n5)除病毒过滤；/n6)超滤换液；/n7)除菌过滤获得原液。/n

【技术特征摘要】
20190425 CN 20191033815781.一种人凝血因子VIIa的纯化方法，包括依次进行的以下步骤：
1)阴离子交换层析；
2)灭活病毒；
3)阴离子交换层析；
4)疏水层析；
5)除病毒过滤；
6)超滤换液；
7)除菌过滤获得原液。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括依次进行的以下步骤：
1)阴离子交换层析；
2)对步骤1)所得产物进行病毒灭活；
3)采用阴离子交换层析进一步纯化步骤2)所得产物；
4)采用疏水层析进一步纯化步骤3)所得产物；
5)对步骤4)所得产物进行除病毒过滤；
6)对步骤5)所得产物进行超滤换液；
7)对步骤6)所得产物进行除菌过滤获得原液。


3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中采用阴离子交换层析从细胞收获液中捕获目的蛋白，该步阴离子交换层析可选地包括(a)平衡阴离子交换材料，(b)淋洗阴离子交换材料，和(c)洗脱阴离子交换材料。


4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用S/D法进行病毒灭活。


5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)可选地包括(a)平衡阴离子交换材料，(b)淋洗阴离子交换材料，和(c)洗脱阴离子交换材料，其中平衡...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦宇，陈梅梅，胡宏飞，刘世萍，刘翔，张入仁，魏京楠，张永波，姚跃，
申请(专利权)人：正大天晴药业集团股份有限公司，正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32