一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，所述的表达纯化方法包括：通过自诱导培养系统诱导原核系统表达人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子；利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化原核系统表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂；利用稀释透析技术对人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子进行复性。本发明专利技术提供的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法操作简单，成本低，蛋白质表达量大，蛋白产率高。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法。
技术介绍
组织型纤溶酶原激活剂又称组织型纤溶酶原激活物(tissue-typeplasminogenactivator，t-PA)或纤溶酶原激活因子(tissueplasminogenactivator)，是体内纤溶系统的生理性激动剂，在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用。t-PA属于糖蛋白中的丝氨酸蛋白酶类，是人体特有的蛋白质，由527个氨基酸组成，其中包括35个半胱氨酸残基，它们参与形成17个二硫键，能够专一水解纤溶酶原，形成纤溶酶，激活纤溶系统，对于清除血管内不溶性纤维蛋白，保证血液循环畅通起重要作用，药用t-PA能高效地预防和治疗急性心肌梗死等血栓性疾病。目前对组织型纤溶酶原激活剂的研究多侧重于其突变体的研究，如CN103159860，CN107177611，CN103509772等，且以真核表达居多，如CN101717430，CN1468862。在现有技术中存在细胞株筛选困难，时间长，蛋白表达量低，成本高，耗时耗力等问题，不利于对t-PA本身结构与功能的研究。因此需要一种原核表达纯化t-PA的方法，具有操作简单、表达量高、成本较低的优势。中国专利201410389379.X中公开了一种组织型纤溶酶原激活剂的构建、表达纯化方法。该专利技术涉及组织型纤溶酶原激活剂重组质粒的构建、原核表达及纯化技术，在含有人tPA全长基因质粒基础上在N端引入能去除载体上标签的3C序列，C端引入提高靶向性的RGDS序列，以PQE30为载体构建PQE30-rt-PA重组质粒，再通过自诱导方法诱导表达，采用超声法破菌处理后，用Ni2+亲和层析柱纯化r-tPA蛋白，然后再用PreScission蛋白酶切除融合蛋白上的3C短肽，从而去除His-Tag标签，再用分子筛进一步纯化，得到高纯度的r-tPA蛋白。但其纯化步骤较为复杂，容易造成制备蛋白产率低的问题，有待进一步改进。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种含有人组织型纤溶酶原激活剂t-PA的表达纯化方法，可用于心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发。一方面，本专利技术提供了一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法。所述的表达纯化方法包括：通过自诱导培养诱导原核系统表达人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子。所述的表达纯化方法还包括：利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化原核系统表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂。所述的表达纯化方法还包括：利用稀释透析技术对人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子进行复性。进一步地，所述的原核系统包括但不限于pET30a-tPA质粒。进一步地，所述的自诱导培养系统包括常规自诱导培养基。优选地，所述的自诱导培养基为ZYM-5052自诱导培养基，所述的ZYM-5052自诱导培养基为中性培养基，包括以下成分：氮源N-Z-amine(％)1-2酵母提取物(％)0.5-1Na2HPO4(mM)20-30KH2PO4(mM)20-30NH4Cl(mM)4-60Na2SO4(mM)3-6MgSO4(mM)1-3甘油(％)0.4-0.8葡萄糖(％)0.04-0.06乳糖(％)0.1-0.4优选地，所述的丝氨酸蛋白酶亲和层析柱为BenzamidineSepharose4FF亲和层析柱。进一步地，所述的表达纯化方法包括以下步骤：(1)从cDNA文库获得编码t-PA蛋白的基因，将其连接于原核表达载体pET30a，获得重组pET30a-tPA质粒；(2)将上述重组质粒转化入E.coliOrigami2(该细胞株能够更加高效的在细胞质内生成二硫键，有助于含二硫键蛋白的形成)(DE3)细胞，将含有该重组质粒的Origami2菌株于MDG培养基中活化，后在ZYM-5052自诱导培养基中经过扩大培养，IPTG通过自诱导表达得到含t-PA蛋白的包涵体；(3)在变性条件下，以BenzamidineSepharose4FF亲和层析柱进行纯化，利用稀释透析技术复性后通过HPLC以C4反向色谱柱进一步得到正确折叠的t-PA蛋白质。进一步地，所述的步骤(3)中稀释透析技术为根据t-PA分子的摩尔消光系数计算初步纯化的蛋白质浓度，以BufferD(0.1MTris，6MUrea，pH7.0)稀释为0.1-0.3mg/mL，装入干净的透析袋中并于室温下透析复性至少12小时。另一方面，本专利技术提供了一种重组人组织型纤溶酶原激活剂。所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂通过前述的表达纯化方法制备。再一方面，本专利技术提供了前述表达纯化方法在制备重组人组织型纤溶酶原激活剂中的应用。又一方面，本专利技术提供了前述表达纯化方法在心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发中的应用。又一方面，本专利技术提供了前述重组人组织型纤溶酶原激活剂在心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的药物开发中的应用。又一方面，本专利技术提供了一种治疗心肌梗死等心脑血管疾病溶栓治疗的医学配制品。所述的医学配制品中包括前述重组人组织型纤溶酶原激活剂。本专利技术提供的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法具有以下优点：原核表达技术操作简单，成本低，蛋白质表达量大，通过自诱导系统可得到高于现有技术中IPTG诱导的高产量蛋白；稀释透析的复性技术不需要分子伴侣的参与，省略了除去分子伴侣的步骤，有利于提高产率；利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化t-PA分子，不需要对t-PA进行改造，不需要添加标签，能够简化纯化步骤，提高产率。附图说明图1为乙腈梯度洗脱正确折叠的t-PA蛋白，乙腈浓度(25％-65％)随时间的梯度变化。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本专利技术，仅用于说明本专利技术。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法1、利用cDNA文库将t-PA基因进行PCR扩增，通用方法设计引物将t-PA基因连接至基因工程载体pET30a，构建pET30a-tPA质粒。2、将构建好的pET30a-tPA质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的LB培养基平板，LB培养基成分如下：酵母提取物(Yeastextract)5g/L胰蛋白胨(Tryptone本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的表达纯化方法包括：通过自诱导培养诱导原核系统表达人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子；/n所述的表达纯化方法还包括：利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化原核系统表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂；/n所述的表达纯化方法还包括：利用稀释透析技术对人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子进行复性。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的表达纯化方法包括：通过自诱导培养诱导原核系统表达人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子；
所述的表达纯化方法还包括：利用丝氨酸蛋白酶亲和层析柱纯化原核系统表达的重组人组织型纤溶酶原激活剂；
所述的表达纯化方法还包括：利用稀释透析技术对人组织型纤溶酶原激活剂蛋白质分子进行复性。


2.根据权利要求1所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的自诱导培养基为ZYM-5052自诱导培养基，所述的ZYM-5052自诱导培养基为中性培养基，包括以下成分：








氮源N-Z-amine(％)
1-2


酵母提取物(％)
0.5-1


Na2HPO4(mM)
20-30


KH2PO4(mM)
20-30


NH4Cl(mM)
4-60


Na2SO4(mM)
3-6


MgSO4(mM)
1-3


甘油(％)
0.4-0.8


葡萄糖(％)
0.04-0.06


乳糖(％)
0.1-0.4






。


3.根据权利要求1所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的丝氨酸蛋白酶亲和层析柱为BenzamidineSepharose4FF亲和层析柱。


4.根据权利要求1所述的重组人组织型纤溶酶原激活剂的表达纯化方法，其特征在于，所述的稀释透析技术为根据t-PA分子的摩尔消光系数计算初步纯化的蛋白质浓度，以BufferD稀释为0.1-0.3mg/mL，装入干...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊杰，王静，陈诗，熊心磊，邓霞飞，
申请(专利权)人：武汉人福药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42