制备免疫球蛋白组合物的方法技术

本发明专利技术提供一种从包含免疫球蛋白的血浆中制备免疫球蛋白组合物的方法，以及用该方法制得的抗体制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备病毒安全的免疫球蛋白组合物的方法，以及能够利用此方法制备的抗体制剂和药物组合物。
技术介绍
从人类血浆制备的且适合于静脉内施用的免疫球蛋白组合物在本领域中是已知的，且数十年来在多种疾病的治疗中起着重要作用。免疫球蛋白用于例如治疗人体感染，并且可以分为具有不同生化和生理性质的多种类别。免疫球蛋白G参与抵御病毒抗原，而IgM则主要在抗细菌和抗毒素的免疫应答中具有活性。免疫球蛋白溶液包含占各种百分比的IgG、IgA和IgM，且不同的制剂具有不同的 治疗应用，例如，IgM百分比较高的制剂用于预防或治疗细菌感染。与IgG制剂相比，IgM抗体易于在溶液中聚集。IgM制剂难以稳定化，尤其是在其与血浆浓度相比有所富集且储存在液体溶液中时。免疫球蛋白溶液通常从血浆或血清的组分(例如Cohn组分)中制得。随后对这些组分进行多个纯化步骤来除去包括病毒、变性蛋白、蛋白酶和脂质在内的污染物。用于组分分离的人类血清采集自数千供体，尽管对来源血浆进行了全面检测，但仍可能含有病原体病毒。因此，为了获得安全的用于医药应用的产品，用于使病毒灭活或除去病毒的处理步骤必不可少。用于病毒灭活/去除的若干种技术在本领域中是已知的，例如化学处理、UVC光照射或纳米过滤，实施这些技术是为了确保总体病毒安全性。然而，这些步骤可能对免疫球蛋白的活性具有负面影响；例如，过长的UVC照射时间可以使在最终免疫球蛋白溶液中所获得的天然的具有活性的IgM的产率降低。通过使用生产过程的实验室规模模型验证了这些处理步骤的病毒去除或灭活能力，并且对每个步骤都确定了去除或灭活系数。灭活/去除系数的提高为药物产品增添了额外的病毒安全性。现今，来自主管机构的准则要求在制造源自血浆的药物时至少有两个针对有包膜和无包膜的病毒的有效步骤。除了潜在的病毒以外，还有必要除去例如蛋白酶、蛋白聚集体和变性的免疫球蛋白等其他污染物，从而获得耐受良好的产品。对患者而言，变性的免疫球蛋白尤其是潜在的风险，因为其非特异性地激活补体的能力很高，从而在接受这些变性免疫球蛋白的患者中产生严重的副作用。该抗补体活性(ACA)通过《欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia)》中描述的标准化测试来测量。为了(I)在静脉内施用后使患者对产品耐受、(2)确保产品符合有关病毒污染的生物安全性准则、(3)使产物在长期储存过程中稳定和(4)产生所需的化合物混合物/药物组合物，除去所有上述污染物是必须的。已使用经典的Cohn血浆组分分离法或其公知的变形方法(例如Cohn/Oncley，Kistler/Nitschmann)对人IgM溶液进行了初步纯化。使用冷乙醇沉淀法，将IgM组分回收在组分III或组分I/III (亦称为B或B+I)中。已描述了用来从组分III或Ι/III开始对富集有IgM的蛋白溶液进行纯化的方法。EP0013901描述了从组分III开始的纯化方法，包括使用辛酸的步骤、使用β_丙内酯的步骤和使用阴离子交换树脂的吸附步骤。该方法用于生产Penmglobhi ——迄今为止唯一的市售静脉内IgM产品。EP0352500描述了通过以下方法制备具有降低的抗补体活性的用于静脉内应用的IgM浓缩物使用阴离子交换层析、β-丙内酯、UVC光照射，并在升高的温度(40°C 60°C)下进行温育步骤。丙内酯是为了使潜在的病毒灭活而在灭菌步骤中使用的公知化学物质。由于β_丙内酯是可引起蛋白化学修饰的反应性很强的物质，所以免疫球蛋白的抗病毒活性和抗细菌活性也会有大量损失。用该方法制造的制剂因所述化学修饰而在液体溶液中仅在有限的时间内保持稳定。IgM的浓度超过总免疫球蛋白含量的50%。在ΕΡ0413187 (Biotest,生物测试股份公司)和EP0413188 (Biotest,生物测试股份公司)中，已描述了未经丙内酯化学修饰的IgM富集的蛋白溶液的制备。这些方法包括从Cohn组分III或ΙΙ/ΙΙΙ开始对适合的蛋白溶液进行辛酸处理和阴离子交换层析。在专利ΕΡ0413187 (Biotest，生物测试股份公司)中，辛酸处理通过搅拌15分钟来进行，以除去存在于Cohn组分III中的脂质。·由于要向患者静脉内施用大量的免疫球蛋白，所以必须获得可耐受的药物制剂。据已有描述，难以将IgM制剂制备成用于静脉内应用。就天然性质而言，IgM在结合抗原后是补体的强力活化剂。因此，对患者而言，变性的IgM分子的非特异性抗补体活性比变性的IgG分子要危险得多。EP0413187所述的制剂具有低抗补体活性，即O. 6 0.8CH50/mg蛋白，但是必须对其进行稳定化和用β-丙内酯进行病毒灭活。根据针对免疫球蛋白的EP专论，认为低抗补体活性为彡lCH50/mg蛋白。EP0413188B1 (Biotest，生物测试股份公司)描述了为了降低抗补体活性而使用阴离子交换层析来制备用于静脉内施用的富集有IgM的制剂。此外，还描述了在pH 4 4.5且在40°C 60°C、优选50°C 54°C进行热处理以降低抗补体活性。必须将该制剂冻干以确保该制剂持续数月的稳定性。未能显示出液体溶液的长期稳定性。另一种方法描述了在pH 4.0 5.0和在401 621、优选451 551通过利用对IgM制剂的温和热处理(EP0450412，Miles)来减少非特异性补体活化。在该专利申请中，将辛酸添加到Cohn组分III悬浮液中，从而通过离心除去前激肽释放酶活化剂和脂蛋白。但是，该处理会导致IgM的抗原决定簇部分丢失。这可能会使产生新生抗原的风险升高，从而导致人体内免疫原性增加或活性丧失。EP0835880 (US 6136312, ZLB)中已描述了在辛酸沉淀步骤后使用蛋白酶处理(例如，用胃蛋白酶)来制备用于静脉内应用的含IgM的蛋白溶液。蛋白酶处理使免疫球蛋白分子发生部分片段化，从而破坏了 Fab和Fe部分的完整功能活性。因此，经蛋白酶处理的免疫球蛋白不能认为是未经修饰的免疫球蛋白。此外，该制备方法会产生约5%的分子量小于IOOkD的片段。用来进行辛酸处理的已描述的方法(EP0413187和EP0835880)的缺点在于，辛酸处理在除去和灭活无包膜病毒方面并不有效，且不会除去几乎全部的蛋白水解活性。在EP 0345543 (Bayer, Miles)中，公开了用于治疗用途的含有至少33%IgM的高度浓缩的IgM制剂,该制剂基本不含同种凝集素效价(isoagglutinin titre)。在该专利申请中，通过添加辛酸来进行辛酸沉淀，并通过Synsorb亲和层析来除去同种凝集素。最终制剂必须冷冻干燥。总之，如果利用化学手段或酶手段对免疫球蛋白进行修饰，和/或通过层析进一步纯化，和/或进行温和热处理，则可以制造出具有低抗补体活性的含IgM的制剂。但是，产生未修饰的免疫球蛋白制剂的现有技术的方法不能实现针对所有潜在病毒的病毒灭活能力。虽然若干种方法(例如溶剂/去垢剂处理、辛酸处理、纳米过滤和热处理)可有效地灭活或除去有包膜病毒，但是仅有几种已知方法可灭活或除去无包膜病毒，例如细小病毒。这些无包膜病毒大部分都非常小，通常会穿过孔径大于20nm的纳米过滤器。而该孔径对于直径可高达30nm的IgM分子而言过小。无包膜病毒可被例如β-丙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·莫勒尔，D·鲁德尼克，O·曼尼格，M·罗德梅尔，H·德切特穆勒尔，E·费尔切塞格，
申请(专利权)人：生物测试股份公司，
类型：
国别省市：