飞蝗丝氨酸蛋白酶1及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了飞蝗丝氨酸蛋白酶1及其编码基因与应用。本发明专利技术首先从飞蝗中克隆了飞蝗丝氨酸蛋白酶1基因LmSPN1，并对飞蝗丝氨酸蛋白酶1基因LmSPN1设计引物，合成了用于干扰飞蝗丝氨酸蛋白酶1基因LmSPN1的dsRNA，且运用注射法将dsRNA导入飞蝗对飞蝗丝氨酸蛋白酶1基因LmSPN1进行RNAi。结果表明：通过干扰飞蝗丝氨酸蛋白酶1基因LmSPN1可调控飞蝗滞育。本发明专利技术为更深入理解飞蝗滞育机制、创制新的生物农药制剂提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
飞蝗丝氨酸蛋白酶1及其编码基因与应用
本专利技术属于生物防治
，具体涉及飞蝗丝氨酸蛋白酶1及其编码基因与应用。
技术介绍
丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serineproteaseinhibitors，Serpins)是一类丝氨酸和酪氨酸蛋白酶抑制剂超家族，广泛分布于生物界，例如动物、植物和病毒等，几乎存在于所有的生命形式。上世纪80年代，Hunt等人通过对比鸡蛋卵清蛋白和两种人类血清蛋白酶抑制因子：α1蛋白酶抑制因子α1-proteaseinhibitor和抗凝血酶III(antithrombin-III)得到卵清-抗凝血酶超家族ovalbumin-antithrombinsuperfamily，即此后的Serpins超家族。基因组数据分析得到，在多细胞的真核生物中Serpins存在9大类。相反，在原核生物细胞中Serpins只单一地、零星地分布。在系统发育学上，真核生物的Serpins被划分为16分支(类型A-P)，以SERPINXy命名，X代表分支，y代表序号，但在这分类之前，许多Serpins有其他的名字。Serpins基因编码约350～500个氨基酸长度的蛋白质，其作用是抑制丝氨酸蛋白酶和酪氨酸蛋白酶的活性，但极少数的Serpins蛋白不具有抑制作用，而是作为分子伴侣。Serpins在生物体中行使着广泛的生物学功能，例如，SPN43Ac可以通过调节果蝇Drosophilamelanogaster中Toll免疫蛋白联级中的上游蛋白从而调控果蝇的寄主防御机制，SerpinHdd3还可以作为急性期蛋白诱发机体产生非特异性反应达到防御目的；Serpins可以激活昆虫血淋巴中的酚氧化酶前体(prophenoloxidase，proPO)，该酶的活化会诱导表皮受侵染或受伤时的黑色素合成。酚氧化酶前体活化酶(Prophenoloxidase-activatingproteinases，PAPs)是一类剪辑酶，它会被上游的另一类剪辑酶激活。烟草天蛾血淋巴中的Serpin-1J可以抑制PAPs的活性。此外，Spn27A能调控胚胎的发育中与Toll蛋白联级有关的背腹轴成形。能激活Toll的发育信号通路，而控制发育的的活化由Gd、Snake、和Easter组成的特定的蛋白水解联级调控。Spn27A能通过抑制Easter限制Toll途径调控的胚胎发育。Ligoxygakis等人发现，缺乏Spn27A蛋白的雌果蝇产下的卵所形成的胚胎会执行腹侧化的细胞命运；更值得一提的是，果蝇附腺中产生的Spn76A蛋白因不具备多个抑制所需的氨基酸残基而不具有抑制蛋白酶的功能，而是可能作为一种转运激素。Spn76A是昆虫精液中第一个被发现的蛋白，它在雌雄交配后被转运到雌虫的子宫内并在几个小时内会降解大部分。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何防治害虫。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了丝氨酸蛋白酶1。本专利技术提供的丝氨酸蛋白酶1来源于飞蝗(Locustamigratoria)，其名称为飞蝗丝氨酸蛋白酶1，即LmSPN1，为如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示的蛋白质：A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；A3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与滞育相关的蛋白质；A4)与A1)-A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且与滞育相关的蛋白质。为了使上述A1)中的蛋白质LmSPN1便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A3)中的蛋白质LmSPN1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述A3)中的蛋白质LmSPN1的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述A1)或A2)或A3)或A4)中的蛋白质LmSPN1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了与LmSPN1蛋白质相关的生物材料。本专利技术提供的与LmSPN1蛋白质相关的生物材料为下述C1)至C8)中的任一种：C1)编码LmSPN1蛋白质的核酸分子；C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。上述生物材料中，C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：1)序列表中序列1第9-1160位所示的cDNA分子；2)来源于飞蝗的与1)限定的DNA序列具有98％以上同源性且编码滞育相关蛋白的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码滞育相关蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码滞育相关蛋白的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码LmSPN1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的LmSPN1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码LmSPN1且具有相同功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，为如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示的蛋白质：/nA1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；/nA2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；/nA3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与滞育相关的蛋白质；/nA4)与A1)-A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且与滞育相关的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示的蛋白质：
A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
A3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与滞育相关的蛋白质；
A4)与A1)-A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且与滞育相关的蛋白质。


2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述C1)至C8)中的任一种：
C1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。


3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)序列表中序列1第9-1160位所示的cDNA分子；
2)来源于飞蝗的与1)限定的DNA序列具有98％以上同源性且编码滞育相关蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码滞育相关蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码滞育相关蛋白的DNA分子。


4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在如下a1)-a6)中任一种中的应用：
...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂雄兵，张泽华，陈俊，张道刚，朱凯辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11