本发明专利技术公开了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.6135，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体12H7。本发明专利技术还涉及单克隆抗体12H7在制备用于检测β-Catenin蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体12H7的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体12H7在制备用于检测β-Catenin相关性肿瘤的试剂盒中的应用。本发明专利技术所述单克隆抗体可与β-Catenin蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了β-Catenin蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域,特别涉及一种抗β-Catenin的单克隆抗体,产生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体的免疫检测用途。
技术介绍
β -Catenin是环连蛋白家族中的一员，分子量约90kd,为一种多功能蛋白质； β -Catenin是新原癌基因的产物，可与二十多种蛋白质结合，也是一种具有介导细胞粘附及信号传导双重活性的多功能蛋白。β -Catenin蛋白有两个重要功能，一方面它是重要的细胞粘附分子和细胞骨架成分，另一方面它又是fct信号通路中的一个重要成员，在发育过程中指导机体的正常发育，在肿瘤细胞中，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。编码β-Catenin的基因称为CTNNBl，定位于染色体3p21，全长23. 2kb，有16个外显子；Van Nhieu等的研究显示，CTNNBl突变所导致的Wnt信号传导途径异常激活，是恶性肿瘤发生的重要环节。β-Catenin蛋白在细胞中异常表达可见于人类多种恶性肿瘤。细胞中的β -Catenin以两种形式存在游离β -Catenin以及与E_cadherin、APC蛋白等结合形成复合体的β-Catenin，二者共同组成一个“胞内β-Catenin库”，并可互相转换；正常情况下，两者达成一种平衡，一旦这种平衡被打破，则可能造成恶性肿瘤的发生。Dong KyumWo等以及近年来的其他研究均显示，β -Catenin异常的亚细胞定位、聚集与细胞恶性转化、增殖密切相关，并在胃癌、结直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝癌等恶性肿瘤中均得到类似结论。β-Catenin作为肿瘤预后的影响因素，在不同的组织器官具有不同的意义。β -Catenin的免疫组化(IHC)结果显示，结肠癌中胞质和核染色增加可能是预后较差的独立因素，而表达水平的降低或缺失是胃癌和胰腺癌的不良预后因素。β-Catenin核内高表达或细胞膜表达缺失的恶性黑色素瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌的患者生存期短，预后差。目前临床上通常通过免疫组织化学病理实验检测肿瘤细胞中β-Catenin的表达状况。而IHC实验的核心为一抗，即可特异性结合β-Catenin的单克隆抗体,其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性高的抗β -Catenin的单克隆抗体具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为提供一种结合特异性高的抗β-Catenin的单克隆抗体12Η7，及其在制备用于检测β -Catenin蛋白的免疫检测工具中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2012年5月16日，保藏编号为 CGMCC No. 6135。本专利技术还提供了一种特异性结合β-Catenin蛋白的单克隆抗体12Η7,由上述杂交瘤细胞株产生。本专利技术所述单克隆抗体的制备方法如下(I)重组表达载体的构建根据β-Catenin基因的ORF全序列(如SEQ ID No. I所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和Mlul，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列(标签序列如SEQ ID No. 2所示),插入表达载体pCMV6_Entry,构建β -Catenin重组表达质粒(简称为pCMV6_CTNNBl)；(2) β -Catenin重组蛋白的表达与纯化以pCMV6_CTNNBl质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化,获得纯化的β-Catenin重组蛋白；(3)单抗的筛选与制备采用上述β-Catenin重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗β-Catenin特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为12Η7，亚型鉴定为IgGl ;制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化β-Catenin单抗12Η7。分别通过Western Blot (结果见图3)、免疫组化实验(结果见图4-6)验证该单抗的灵敏度和特异性。专利技术人还通过OriGene高密度蛋白芯片验证了上述单克隆抗体的特异性OriGene高密度蛋白芯片上包含10400种HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋 白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。将本专利技术单克隆抗体12H7与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本专利技术单克隆抗体12H7特异性结合β-Catenin蛋白，与其他蛋白无交叉反应。本专利技术的另一个目的在于提供一种单克隆抗体12Η7在制备用于检测β -Catenin蛋白的免疫检测工具中的应用。具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备用于诊断β -Catenin相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。由于β-Catenin蛋白的异常表达、异常亚细胞定位及聚集均与人类多种恶性肿瘤有关，因此使用本专利技术单克隆抗体检测细胞中β-Catenin蛋白的表达状况或亚细胞定位,可用于辅助诊断β -Catenin相关性肿瘤。所述β -Catenin相关性肿瘤为胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝癌、子宫内膜癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌或非小细胞肺癌。本专利技术还提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体12Η7 ;可用于检测组织细胞中β -Catenin蛋白的表达状况。本专利技术所述针对β-Catenin蛋白的特异性单抗12Η7,可与β-Catenin特异结合，提高了实验的特异性和可靠性，并建立了基于单抗12Η7的免疫组织化学技术，主要用于大肠癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、食管癌、非小细胞肺癌等肿瘤的辅助诊断。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为抗人CTNNBl单克隆抗体杂交瘤细胞株12Η7 ；保藏单位全称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称CGMCC ；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期2012年5月16日；保藏编号CGMCCNo. 6135。附图说明 图I为Western blot验证β -Catenin重组质粒在ΗΕΚ293Τ细胞中的表达；左边泳道的上样样品为转染PCMV6空载体的ΗΕΚ293Τ细胞裂解液，右边泳道的上样样品为转染PCMV6-CTNNB1重组质粒的ΗΕΚ293Τ细胞裂解液，杂交所用一抗为抗DDK标签抗体；图2为β -Catenin重组蛋白的SDS-PAGE鉴定图；图3为单克隆抗体12Η7在9种不同细胞系中的Western blot结果；图4为以单克隆抗体12H7为一抗，免疫组化法检测胰腺组织中β -Catenin蛋白的表达；图5为以单克隆抗体12Η7为一抗，免疫组化法检测子宫内膜组织中β -Catenin蛋白的表达；图6为以单克隆抗体12Η7为一抗，免疫组化法检测前列腺组织中β -Catenin蛋白的表达。具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性结合β？Catenin蛋白的单克隆抗体12H7，由保藏编号为CGMCC？No.6135的杂交瘤细胞株产生。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何为无，马东辉，袁克湖，陈坚，王超，陈思，王宜，周春，
申请(专利权)人：无锡傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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