一种批量基因克隆的方法技术

本发明专利技术公开了一种批量基因克隆的方法。此方法包括以下步骤：将具有多个目标性状差异的两个亲本杂交构建分离群体；分离群体中随机选择的基因克隆群体与2个亲本一起基因组高通量测序，比对2个亲本基因组，获得亲本间差异等位位点。按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比。通过统计检验，获得目标性状的候选位点。然后确定目标基因座位。通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。本发明专利技术对同一次实验获得的测序数据进行不同的分组，即可实现克隆多个基因的目的，实现了数据的充分发掘与利用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于遗传学领域，公开了。
技术介绍
自然界物种性状丰富多样，如株高、抗病性、产量等。从孟德尔时代起，就逐渐认识到了性状是由遗传因子控制，摩尔根进一步将遗传因子明确为“基因”，并指出基因位于染色体上且呈线性排列。确定基因在染色体上具体的位置(基因定位)是研究性状的基础，也是分离、克隆并利用基因的前提。经典的基因定位策略源于摩尔根的连锁理论，即染色体上相邻基因(即基因连锁)不能自由分离，而是倾向于整体向后代传递，它们所控制的性状也倾向于同时出 现。二者相邻越近，性状同时出现的可能性越大，重组性状越少。因此，由重组性状(配子)的比 例可以度量二者间的距离。若已知道其中一个基因在染色体上的位置(称这样的基因为标记基因)，就可以根据重组率推断另一个基因的位置。例如，黄色圆粒豌豆品种(基因型分别为YYRR)与绿色皱粒品种(基因型为yyrr)杂交产生F1 (基因型YyRrhF1自交可能产生YR、Yr、yR和yr 4种配子，根据F2代的性状表现可以确定它们的比例，进而计算交换率。若交换率为I %，且已知控制颜色的Y基因位于第3染色体上，那么就可以推测，控制豌豆籽粒形状的R基因位于第3染色体且与Y基因相距lcM。从以上的分析可以看出，经典连锁标记定位的实质是找到与目标性状连锁的已知分子标记，并计算二者的交换率，进而推断目标基因的位置。分离群体分池是基因定位的实际操作策略，以上述实例进行说明如下。以籽粒形状为标准，将F2群体划分为两个部分(池)显性池(随机抽取的圆粒单株)和隐性池(随机抽取的皱粒单株)，比较豌豆基因组上已知的1000个SSR标记(SSR1-SSR1000)扩增产物在这两个池间的差异。若标记SSR17与籽粒形状R/r连锁，那么对籽粒形状分池，也就相当于对SSR17分池，因此，SSR17在两个池间的扩增产物是有差异的，相反就没有差异，由此确定目标基因与SSR17处于同一染色体。再分析F2各个单株的表现，计算R/r与SSR17的遗传距离，即可进一步定位R/r在该染色体上的具体位置。分子标记连锁定位基因经过几十年的发展，已成为基因定位的经典方法，但该方法依旧存在明显缺陷，主要表现如下(I)经典分子标记定位克隆基因时，一次杂交与分子标记实验只针对一个目标性状，很难实现一次实验克隆多个基因的目的，效率不高。(2)大部分物种未开发分子标记，基因克隆还很困难；精细定位区间狭窄，交换率低，计算交换值的实验工作十分庞大；常出现无标记可用，克隆工作无法进行的情况；仅找到含目标基因的区段，需要进行基因预测，假阳性或假阴性的实验结果无法避免。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种利用同一次实验实现多个基因的快速、准确克隆的方法。为了实现上述目的本专利技术采取的技术方案是，包括以下步骤选用在多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体，与两个亲本一起基因组高通量测序并进行基因组初步de novo (直接)组装，对两个亲本基因组进行比对，获得亲本间差异等位位点，按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比，通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3 : I和O : I的等位位点 ，即获得目标性状的候选位点；扩大隐性池群体，PCR、测序逐个检查隐性池中每个个体的每个候选位点，或隐性池候选位点富集后重测序，隐性池中完全没有出现的显性亲本位点即为目标基因座位，通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。本专利技术更具体的技术方案是一种基因克隆方法，包括以下步骤(I)基因克隆群体的构建与遗传分析选择多个目标性状上有差异的材料做亲本，通过杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体；(2)确定目标性状基因候选位点分别提取克隆群体中每个个体和2个亲本的基因组DNA，按高通量测序流程分别构建文库，PCR并高通量测序；按de novo组装，初步构建克隆群体中每个个体和2个亲本全基因组序列。构建过程中，忽略难以正确组装的重复序列(因为它们多数为非蛋白编码基因)。按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比，通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3: I和O : I的等位位点，将它们定义为目标性状的候选位点。(4)目标位点的确定通过两个方式确定目标位点。第一种方式候选位点超过50个时，通过杂交(如安捷伦SureSelect平台)或PCR方式在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，检测显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；第二种方式候选位点不足50个时，可采用普通PCR、实时PCR、SNaPshot (测序)或高通量的OpenArray (定制芯片)检测方式,逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点，没有出现的显性座位位点即为目标位点。(5)基因克隆与功能验证通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。所述亲本杂交构建分离群体是利用遗传距离近的纯系亲本构建。本专利技术实施例的有益效果是(I)利用本专利技术的方法，只需要一次杂交与测序实验，即可实现克隆多个基因的目的。(2)本专利技术依赖于测序而非分子标记，可用于任何生物物种，极大地拓宽了基因克隆与利用范围。直接克隆目标基因本身，而非包含目标基因的区段，结果明确，也不存在无标记可用的问题。大部分步骤有概率保证，具有判断标准，风险大为降低。实验可在较短时间(如数周或数月)内完成，速度大为加快。附图说明图I是本专利技术实施例I提供的植物批量基因克隆方法流程示意图；图2是本专利技术实施例2提供的同时克隆水稻高杆、抗白叶枯、抗稻瘟病基因的方法流程示意具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，但不作为对本专利技术的限定。实施例I :参见图1，一种植物批量基因克隆方法(I)构建分离群体 选择具有多个目标性状差异的两个亲本进行正反交(除目标性状外，其它性状差异越小越好)，通过分子标记或田间性状观察，去除假杂种。根据F1的表现判断控制性状的基因座位是显性还是隐性。根据正反交的性状是否有差异，判断是否具有细胞质效应，若没有差异，表明不受细胞质基因影响，否则该性状与细胞质基因相关。F1自交形成&群体，根据相对性状在F2群体中植株的比例，判断控制目标性状的基因对数，卡方检验若符合3 1的分离比，则为I对基因控制，否则为多对基因控制。F2群体即可作为基因克隆群体，为了方便反复多次观察分离后代每个个体的表现型，继续自交获得重组自交系作为克隆群体，方法如下。从F2代起，不进行任何选择，采用“单粒传”法(每个单株收I颗种子)自交收种并形成后代群体，直至稳定，获得重组自交系。自交过程都在隔离条件下进行，以避免可能的飞花传粉，干扰研究结果。根据杂交亲本亲缘关系的远近，自交稳定的时间长短有一定差异，一般9-10代即可稳定。获得的重组自交系不再分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种批量基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：选用在多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体，提取克隆群体中每个个体与两个亲本基因组一起高通量测序，并进行基因组初步直接组装；对两个亲本基因组进行比对，获得亲本间差异等位位点；按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比；通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，即获得目标性状的候选位点；扩大隐性池群体，PCR逐个检查隐性池中每个个体的每个候选位点或隐性池候选位点富集后重测序，在隐性池中完全没有出现的显性亲本位点即为目标基因座位；通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭海，张静，章伟雄，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：