本发明专利技术公开了一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒及应用，所述试剂盒由磁珠悬浮液、基因提取液和磁架构成；所述基因提取液包括红细胞裂解液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶K工作液、漂洗液1、漂洗液2、漂洗液3和洗脱液；本发明专利技术适于中大量全血基因组DNA的提取，操作简便，只需对红细胞进行简单预处理，即可对大体积的全血样本进行快速提取，1h内可完成操作，适合高通量、自动化提取；反应体系灵活，可根据样品体积作体系的相应调整；不使用苯酚、氯仿等有机溶剂，对操作人员安全无毒副作用；提取效率高，能够从2ml全血中提取20~?60μgDNA，且片段完整。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因组DNA的提取方法，特别涉及一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒及应用。
技术介绍
DNA作为遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。提取基因组DNA是许多分子生物学实验的基础，在诸如基因组测序、Southern杂交、PCR扩增、构建BCA文库、分子克隆等常规实验中，获得高分子量、高纯度的基因组DNA是开展研究工作的重要前提。随着分子生物学技术的深入发展，在基因水平上对疾病进行检测、诊断已经成为临床诊断的一项基本技术手段；尤其是法医学中的个体识别、亲子鉴定等，对所提取基因组DNA的完整性及纯度要求更高。血液取材方便可靠，因此许多研究均以血液作为材料以提取完整的基因组DNA。而出于对实验成本、工作效率等多方面因素的考虑，研究人·员希望尽可能一次性获取最大采血量(2-10ml)的基因组DNA，以进行长期保存，满足长期、反复、多种研究的需要。基因组DNA提取一般需遵循以下几个原则1、保证提取的DNA具有一定的长度；2、纯化后不应存在对没有抑制作用的物质；3、排除有机溶剂和金属离子污染；4、蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。对于范围在2-10ml血样的基因组DNA提取，经典方法是用SDS、蛋白酶k消化，再用酚氯仿反复抽提，此过程不但用到了有毒的苯酚、氯仿，且操作繁琐、耗时耗力，极易造成样本的丢失和污染。目前市场上商品化的离心柱型试剂盒操作简单，但一般只能满足微量全血(100-500ul)的提取需求，而对于中大量血液的基因组提取，则操作中会包含反复的移液、离心，易造成样本的交叉污染。磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法。磁珠是指直径几十纳米至数微米，在磁场下表现出磁性，由无机/有机或者无机/无机材料组成的外形呈现为球状的复合粒子。运用此法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的核酸纯度高、产量大。专利号为 200810200588. X,200910223901. 6,200910307632. 1,201110124322. 3 的专利分别公开了利用磁珠提取核酸的试剂盒或者方法，但都只是针对血液或其他来源样本中的病毒核酸所设计，并未涉及到血液基因组DNA的提取；专利号20101035963. 4的专利公开了 “一种用磁珠分离基因组DNA的试剂盒及其应用”，其应用主要针对于从动植物组织中提取基因组DNA ;专利号201010153890. I的专利公开了一种“血液基因组磁珠小提试剂盒极其提取方法”，此试剂组成和方法，只适用于小样本量(50-200ul)血液的基因组DNA提取，对于大体积样本的提取，则容易受到红细胞及血液其他组分的干扰和污染，无法适用于对基因组需求量较大的试验研究，这也是目前国内市场上磁珠法全血基因组试剂盒所面临的技术瓶颈。因此，提供一种可从大体积全血样本中提取基因组DNA的方法和试剂盒，并且操作简单、成本低廉、提取的基因组产量高、质量佳，对于满足临床诊断和研究人员对样本长期保存、反复使用的需求是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用磁珠提取中大量全血基因组DNA的方法和试剂盒，特别针对较大样本量(2-10ml)的全血材料，经过对血液组分的简单处理，即可去除大部分杂质，利用单分散磁性微球特异吸附基因组DNA，仅需简单的漂洗步骤，即可获得产量高、纯度好、片段完整的基因组DNA，适用于PCR检测、酶切反应、分子杂交、测序等下游实验。本专利技术采用的技术方案是一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒由磁珠悬浮液、基因提取液和磁架构成；所述磁珠悬浮液以氯化铁和氯化亚铁为磁性材料，在氮气和氢氧化钠的作用下，通过化学共沉淀形成磁性粒子，再将磁性粒子用硅酸钠修饰，水分散，获得所述磁珠悬浮液；所述基因提取液包括红细胞裂解液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶K工作液、漂洗液I、漂洗液2、漂洗液3和洗脱液；所述红细胞裂解液终浓度组成为10(T200mmOl/L氯化铵、5 20mmol/L钾盐，O. 05 O. lmmol/LEDTA，溶剂为水，pH 为 7. 0 8· O ；所述细胞裂解液终浓度组成为50 200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐a、5(Tl00mmol/L螯合剂、500 800mmol/L钠盐和质量终浓度O. 5^5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为7. (Γ8. 0，所述螯合剂为EDTA (乙二胺四乙酸)；·所述结合液终浓度组成为2 8mol/L离液盐a、0. 2^2mol/L醋酸钠，溶剂为水，pH为4. (Γ6. 0，所述离液盐a为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠或氯化锂；所述漂洗液I终浓度组成为1 4 mo I/L的离液盐b，0. f 2mol/L醋酸钠，体积终浓度2(Γ30%的无水乙醇，溶剂是水，pH值4.(Γ 6. 0，所述离液盐b为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠；所述漂洗液2终浓度组成为1 4 mol/L的离液盐c，0. f 2mol/L醋酸钠，体积终浓度5(Γ70%的无水乙醇，pH值4. (Γ 7. 0，溶剂为水，所述离液盐c为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠；所述漂洗液3为体积浓度75%无水乙醇溶液或无水乙醇；所述洗脱液终浓度组成为l(T20mmOl/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.5mmol/LEDTA 水溶液，pH9. O。所述蛋白酶K工作液在试剂盒中的终浓度为20mg/mL。进一步，所述磁珠以磁珠悬浮液的形式存在，即每毫升磁珠悬浮液中含有直径为1-5 μ m的磁珠50mg,其余为水。进一步，所述磁珠悬浮液按如下方法制备(I)磁性粒子的配制首先对4mol/L的氢氧化钠水溶液通氮气进行除氧处理，然后将氢氧化钠水溶液置于80°C的水浴中并持续通入氮气；其次，将O. 5mol/L氯化铁水溶液与O. 5mol/L氯化亚铁盐酸溶液以体积比2:1混合，缓慢倒入上述水浴中的氢氧化钠水溶液中，搅拌反应30min，将反应液静置冷却沉淀，去除上清；最后取沉淀用无水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氢氧化钠水溶液与氯化铁水溶液和氯化亚铁盐酸溶液的总体积比为1:0. 6 ；(2)磁性粒子修饰配基取上述磁性粒子用去离子水a进行超声分散，获得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子分散液中分别加入无水乙醇a、质量浓度22 25%浓氨水、体积浓度40%的正硅酸乙酯的乙醇溶液，在400rpm下搅拌24小时，将反应混合液用乙醇与水分别清洗三次，最后用4ml去离子水b分散，获得所述磁珠悬浮液；所述去离子水a的体积用量以磁性粒子质量计为100ml/g,所述无水乙醇a体积用量以磁性粒子质量计为400ml/g,浓氨水体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液体积用量以磁性粒子质量计为5ml/g。进一步，所述红细胞裂解液终浓度组成优选为150mmol/L氯化铵、lOmmol/L碳酸氢钾，O. lmmol/L EDTA，溶剂为水，pH 为 7. 4。进一步，所述细胞裂解液终浓度组成优选为100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐a、IOOmmoI/L螯合剂、500mmol/L氯化钠和质量终浓度0. 5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为8. O，所述螯合剂为EDTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用磁珠提取全血基因组DNA的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由磁珠悬浮液、基因提取液和磁架构成；所述磁珠悬浮液以氯化铁和氯化亚铁为磁性材料，在氮气和氢氧化钠的作用下，通过化学共沉淀形成磁性粒子，再将磁性粒子用硅酸钠修饰，水分散，获得所述磁珠悬浮液；所述基因提取液包括红细胞裂解液、细胞裂解液、结合液、蛋白酶K工作液、漂洗液1、漂洗液2、漂洗液3和洗脱液；所述红细胞裂解液终浓度组成为：100~200mmol/L氯化铵、5~20mmol/L钾盐，0.05~？0.1mmol/L？EDTA，溶剂为水，pH为7.0~8.0；所述细胞裂解液终浓度组成为：50？~？200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐a、50~500mmol/L螯合剂、500？~？800mmol/L钠盐和质量终浓度0.5~5%十二磺基硫酸钠，溶剂为水，pH为7.0~8.0，所述螯合剂为EDTA；所述结合液终浓度组成为：？2~8mol/L离液盐a、0.2~2mol/L醋酸钠，溶剂为水，pH为4.0~6.0，所述离液盐a为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠或氯化锂；所述漂洗液1终浓度组成为：1？~？4？mol/L的离子液盐b，0.1~2mol/L醋酸钠，体积终浓度20~30%的无水乙醇，溶剂是水，pH值4.0~？6.0，所述离液盐b为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠；所述漂洗液2终浓度组成为：1~4？mol/L的离液盐c，0.1~2mol/L醋酸钠，体积终浓度50~70%的无水乙醇，pH值4.0~？7.0，溶剂为水，所述离液盐c为盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠或高氯酸钠；所述漂洗液3为体积浓度75%无水乙醇水溶液或无水乙醇；所述洗脱液终浓度组成为：10~20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.5mmol/L？EDTA水溶液，pH9.0。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴箭，王珺，张琼，
申请(专利权)人：杭州硕航生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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