用于平行分离和/或纯化RNA和DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于从经固定的同一生物样本中平行分离和/或纯化RNA和DNA的方法，以及根据本发明专利技术方法分离的核酸进行定量和分析，本发明专利技术还涉及一种用于从经固定的样本中平行分离和/或纯化RNA和DNA的试剂盒以及该试剂盒在关于疾病治疗的疗法和/或监视的诊断、预后、决策中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于平行分离和/或纯化RNA和DNA的方法本专利技术涉及一种经固定的同一生物学样本中平行分离和/或纯化RNA和DNA方法，以及根据本专利技术方法分离的核酸的定量和分析，本专利技术还涉及一种用于从经固定的样本中平行分离和/或纯化RNA和DNA的试剂盒，以及该试剂盒在关于疾病治疗的疗法和/或监视的诊断、预后、决策中的应用。如果将生物学材料，如组织碎片或分离的细胞，从活的生物体中移除，细胞就会在短时间内死亡。很快地，死亡的细胞先通过自我分解或发酵作用，然后被细菌分解，从而破坏原始细胞和组织结构。如果细胞或组织碎片从生物体中移除用于组织学检查，推荐对移除的(taken)生物学样本进行固定从而防止降解。理想地是，固定后的样本结构大体上没有改变，允许进行组织学评价。固定还允许对样本进行长时间保存和存档(archiving)。由于这些原因，只有以经固定的材料为基础才有可能进行许多形态学检查。通常，使用使蛋白沉淀或蛋白交联的化合物完成固定，如酸类、醇类、酮类或醛类，特别是戊二醛或甲醛。在这里，用甲醛(以水(性)溶液的形式使用，被称为“福尔马林”)进行固定，然后将经固定的样本包埋于石蜡中，这在病理学中是特别重要的，这是因为细胞和组织结构保存得特别好。在下文中，以这种方式固定的材料被称为“经福尔马林固定的、石蜡包埋的材料”或“FFPE材料”。然而，样品的固定，特别是用福尔马林固定，具有不足之处，这是由于甲醛导致的交联效应，不仅蛋白质，而且存在于样本中的各种其他生物分子包括核酸，互相共价交联，因此，将核酸分子(DNA或RNA)从这样的样本中分离是非常困难的。但是，对于许多分子水平的调查来说，核酸的分离是非常重要的。在WO 2007/068764中，描述了一种从这样经固定的样本中分离核酸的方法。所描述的方法使得打断生物样本中经固定形成的交联以及分离一种类型的核酸(或DNA，或RNA)成为可能，然后可以进行，例如PCR或RT-PCR分析。在分子病理学领域，例如对肿瘤紊乱的诊断或预后，既使用基于DNA的分析又使用基于RNA的分析。为了允许在同一的经固定的样本(如肿瘤样本)上进行基于DNA和RNA的分析，需要一种允许从一个样本(例如活体组织切片检查中的组织切片)中平行分离DNA和RNA的方法。这样的从一个样本中平行分离DNA和RNA是非常需要的，因为，首先，通常可以获得的样本材料的量很少，不足以用于多个独立的纯化。其次，样本材料的组成一般来说是不均质的；例如，在健康细胞的基质中只存在非常少的肿瘤细胞。在这种情况下，由于不可能保证在每一分样中不同细胞彼此间的比例都是相同的，因此分割样本是不可取的。只有从单一的没有分开的样本中平行分离DNA和RNA，才能保证要研究的全部分析物以相同的比例存在,并且来自于完全相同组成的样本。WO 2007/068764中描述的方法，通过同样地打断在固定中引入的交联，释放两种类型的核酸，DNA和RNA。因此该方法只允许分离DNA、或者RNA，或者两种核酸的混合物；然而，它不允许在分开的部分中平行分离DNA和RNA。为了分离两种类型的核酸(DNA和RNA)，WO 2007/068764建议，在分离之后，对纯化过程同时释放的两种类型的核酸中的一种进行选择性的沉淀或选择性吸收。或者，可以用酶法降解单独的不需要的核酸类型。一种通过选择性吸收从样本中平行纯化DNA和RNA的方法是已知的，并且是可以实现的，例如，市场上可以购买的Allprep DNA/RNA试剂盒(凯杰有限公司，希尔登，德国)。在这里，样本首先用含有离液剂而没有任何醇的裂解缓冲液进行溶解，存在于溶解产物中的DNA与硅基质结合，而另外存在于溶解产物中的RNA依然独立于溶液中。然后向剩下的溶解产物中添加乙醇，RNA会进一步与硅基质结合。这一方法对非固定的样本有效。但是，由于这里DNA没有定量地(quantitatively)与第一娃基质结合,而是大量地存在于残留的溶解产物中并于RNA —起被纯化，因此已发现这一方法对福尔马林固定的样本仍不是最佳适用的。因此,这个方法不允许RNA和DNA的独立纯化。W02005/075642描述了一种从生物学样本(包括FFPE样本)中同时提取DNA和RNA的方法。用含有离质序列高的介质、离子去污剂和蛋白水解酶的裂解缓冲液对FFPE样本进行脱蜡和消化。样本至少消化5小时，优选10小时，从而释放RNA和DNA，加入苯酚-氯仿，相被分离。水相主要包括RNA，有机相主要包括DNA。使用乙醇沉淀可以从水相中回收RNA。从有机相中回收DNA。该方法存在特别的缺点，即在将所述核酸从有机相和水相分别分尚之前，为了能够将RNA从DNA中分离，需要使用苯酚对释放的核酸进行提取。·在O ^ Shea等人的“使用从福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取的RNA分析T细胞受体 beta 链 CDR3 的大小”(“Analysis of T cell receptor beta chain CDR3 sizeusing RNA extracted from formalin fixed paraffin wax embedded tissue”)(临床病理学杂质(J Clin Pathol)，1997 ;50:811-814)描述了类似的标准方法。市售的用于从FFPE样本中分离DNA和RNA的混合物、或DNA、或RNA的试剂盒，也同样是已知的。FFPE RNA/DNA纯化试剂盒(加拿大索罗尔德诺冠生物科技(Norgenjiotek)公司公司)允许在一个洗脱液中分离RNA和DNA的混合物。在这里，为了只获得DNA或只获得RNA，可以特别进行长时间的蛋白酶K消化和核糖核酸酶的处理，从而分离出DNA，或者可以进行短时间的蛋白酶K消化和DNA酶的处理，从而分离出RNA。但是，该试剂盒不允许从一个样本中同时，而允许单独，纯化两种类型的核酸。Agencourt FormaPure试剂盒(美国，马萨诸塞州,丹弗斯，贝克曼库尔特基因组股份有限公司)也允许在一个洗脱液中分离RNA和DNA的混合物，或者经DNA酶消化后分离RNA，但不是同时而是单独分离RNA和DNA。Ambion Recover All FFPE试剂盒(美国，加利福尼亚，福斯特市，应用生物系统有限公司)和QuickExtract FFPE RNA抽提试剂盒(美国，威斯康星,麦迪逊，Epicentre生物技术公司)也提供了一种选择，通过相应的核酸酶消化或者通过适当的热孵育，获得DNA或RNA中的任一种。然而，这些市场上可以买到的试剂盒都不允许从同一的经固定的样本中单独纯化DNA和RNA。此外,WO 2005/075642描述了一种从同一样本中(此外，也可以是一个经固定的样本)同时抽提两种类型核苷酸(RNA和DNA)的方法。该方法包括在样本溶解和使用芳香醇类将酶钝化之后，用一种合适的抽提方法分离两种类型的核酸。然而，在进一步的纯化和/或分离之前，必须通过加入合适的沉淀剂，将核酸从该方法中获得的两相(含有RNA的水相，以及含有DNA的有机相)中沉淀下来。首先，该方法耗费时间，其次，由于沉淀，会有物质损失和/或核酸被沉淀剂污染的风险。相应地，本专利技术的目的是提供一种方法，允许从通过交联固定的同一样本中单独纯化DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·霍兰德，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：
国别省市：