一种分离植物低分子量RNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种分离植物低分子量RNA的方法，主要包括：样品处理，DNA和蛋白质的去除，大分子量RNA的去除，低分子量RNA的获得，低分子量RNA的保存。本发明专利技术提取低分子量RNA过程中对DNA、大分子量RNA和低分子量RNA采用分级沉淀，用30%聚乙二醇（PEG）和1/3体积的无水乙醇沉淀DNA和大分子量RNA，用2/3体积的无水乙醇沉淀低分子量RNA，实现低分子量RNA的富集；提取过程中操作简便、所需时间短，是一种简单、经济、高效的提取高质量植物低分子量RNA的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体地说，涉及一种分离植物低分子量RNA的方法。
技术介绍
低分子量RNA包括大小在20nt 24nt的siRNAs和miRNAs，这类小RNA分子对植物的生长、发育及响应逆境胁迫方面起着重要的调控作用。自从2002年科学家首次在植物中发现miRNAs以来，miRNAs数据库已收录了 4169条植物miRNAs,小RNA分子的研究越来越受到植物科学家的重视。小RNA分子的获得是开展小RNA研究的前提，小RNA的质量直接影响后续实验的开展。不管是用哪种提取方法，都要求所获得的低分子量RNA纯度高、质 量好，没有多酚、多糖等物质的污染。目前，科研上获得植物小RNA的方法主要有以下几种①通过商业试剂盒提取小RNA ;②从总RNA中回收小RNA ;③直接富集小RNA。这3种方法的不同之处主要在于它们分离小RNA的手段。AmbioruStratagene等公司开发的小RNA提取试剂盒是利用高分子材料制成的膜吸附小RNA，然后再从膜上将其回收，这一方法虽然使用方便，但其价格昂贵，而且这些试剂盒不适合小RNA的大量提取。从总RNA中回收小RNA的方法是经典的分离小RNA的方法，该方法首先要从植物组织中分离总RNA (大分子量RNA和低分子量RNA)，然后再利用切胶回收的方法从总RNA中回收低分子量RNA，这一方法耗时长，且小RNA的得率低。文献报导的直接富集小RNA的方法有两种，一种是用7. 5%的聚乙二醇和I. 25mol/L的氯化钠来沉淀大分子量RNA，然后用等体积的异丙醇过夜沉淀回收小RNA ;另外一种是用5%的聚乙二醇和1/9体积的异丙醇来沉淀大分子量RNA，然后用等体积的异丙醇沉淀小RNA，这两种方法虽然小RNA的得率较高，但耗时都相对较长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简单、高效的提取高质量植物低分子量RNA的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种分离植物低分子量RNA的方法，包括如下步骤I)样品处理称取O. 5g新鲜的幼嫩植物叶片，放进盛有液氮的研钵中，研磨成粉末，然后将粉末迅速转移至15ml的离心管中，加入经65°C预热的CTAB提取缓冲液5ml和β -巯基乙醇200 μ 1，震荡混匀；所述的CTAB提取缓冲液的成分为2%十六烷基三甲基溴化铵，25mmol/L乙二胺四乙酸，2mol/L氯化钠，3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷(ρΗ8· O) , O. 5g/L 亚精胺；2)DNA和蛋白质的去除在上述离心管中加入水饱和酚氯仿异戊醇(25 24 I)溶液5ml，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4°C，12000rpm离心20min ;离心后将离心管中的上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24 I)溶液，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4°C，12000rpm离心IOmin ;离心后将离心管中的上清液转移至新的离心管中，再次加入等体积氯仿异戊醇(24 I)溶液，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4°C，12000rpm离心IOmin ;上清液中的蛋白质和DNA被沉淀，RNA存留于上清液中；3)大分子量RNA的去除转移上述离心管中的上清液至新的离心管中，加入1/4体积的30%聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液，混匀后冰浴30min，然后在4°C，13000rpm离心IOmin ;再将离心管中的上清液转移至新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，混匀后于4°C，13000rpm离心5min ;上清液中的大分子量RNA被沉淀，低分子量RNA存留于上清液中；4)低分子量RNA的获得转移上述离心管中的上清液至新离心管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5. 2)溶液和2/3体积的无水乙醇，混匀后于4°C，13000rpm离心lOmin，所得沉淀物即为低分子量RNA ;然后用75%乙醇将离心管中的沉淀清洗两次，获得低分子量RNA ； 5)低分子量RNA的保存将低分子量RNA沉淀风干后，用50 μ I DEPC水溶解沉淀，然后将其转入I. 5ml离心管中，-80°C保存备用。本专利技术所用的植物材料为木瓜、香蕉、橡胶树的新鲜叶片。低分子量RNA质量评价过程中所用到的引物和接头序列如下PCR-F TCGGACCAGGCTTCATTCCCCPCR-R AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC5，接头CGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAA反转录弓I物AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC (T) 30VN本专利技术的优点在于①整个提取过程操作简便、实验成本低、提取过程所需时间短，用150min即可完成低分子量RNA的提取提取过程中对DNA、大分子量RNA和低分子量RNA采用分级沉淀，用30%聚乙二醇(PEG)和1/3体积的无水乙醇沉淀DNA和大分子量RNA，用2/3体积的无水乙醇沉淀低分子量RNA ;③本方法所分离到的小RNA分子适用于进一步的低分子量RNA相关研究，用电泳和紫外分光光度法对所提取的低分子量RNA进行检测，结果表明，用本方法提取的橡胶树、香蕉和木瓜低分子量RNA质量高，电泳条带清晰，无拖尾(图1)，纯度好，得率高(表I);用RT-PCR法对提取的橡胶树低分子量RNA进行HbmiR166的扩增检测，结果表明，提取的橡胶树小RNA中包含有HbmiR166 (图2，图3)。表I不同材料的低分子量RNA的纯度和得率_材料_A260/280_A260/230_得率(gg/g·鲜重)垮拎说2.09±0.012.07=0.06190.9±19.5 M 1.84+0.05 2.00=0.04 174.6+I8.9__2.05 土 0.06_2.09:0.09_216.9 士 33.6注平均值土标准差来自3次重复实验。附图说明图I :利用本专利技术提取的植物低分子量RNA在I. 0%琼脂糖甲醛变性胶中的电泳图-i'TfeP曰。泳道I为木瓜低分子量RNA,泳道2为香蕉低分子量RNA,泳道3为橡胶树低分子量RNA，泳道4为木瓜的PEG6000沉淀物，泳道5为香蕉的PEG6000沉淀物，泳道6为橡胶树的PEG6000沉淀物。图2 :橡胶树HbmiR166的扩增结果。泳道I 泳道4分别为4次重复，M泳道为20bp ladder marker。图3 :橡胶树HbmiR166扩增产物的测序结果。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施本专利技术时，可用木瓜、香蕉、橡胶树的新鲜叶片。实施步骤为 (I)称取O. 5g叶片，用液氮研磨成粉末后，迅速将粉末转移至15ml的离心管中，并在离心管中加入经65°C预热的CTAB提取缓冲液5ml和β -巯基乙醇200 μ 1，震荡混勻;接着在离心管中加入水饱和酚氯仿异戊醇为(25 24 I)溶液5ml，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在 4°C, 12000rpm 离心 20min。(2)转移上述离心管中的上清液至新的离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(24 I)溶液，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4°C，12000rpm离心IOmin ；(本步骤重复一次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离植物低分子量RNA的方法，其特征在于包括样品处理、DNA和蛋白质的去除、DNA和大分子量RNA的去除、低分子量RNA的获得、低分子量RNA的保存；所述的样品处理加入的CTAB提取缓冲液的成分为：2%十六烷基三甲基溴化铵,25mmol/L乙二胺四乙酸,2mol/L氯化钠,3%聚乙烯吡咯烷酮（PVP？40）,100mmol/L三羟甲基氨基甲烷（pH8.0）,0.5g/L亚精胺。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：安泽伟，李雅超，谢黎黎，翟琪麟，胡彦师，程汉，黄华孙，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：