本发明专利技术公开了用于基因缺失分析的方法、探针组、试剂盒和组合物。在某些实施方案中，方法涉及制备缺失分析使用的探针、进行缺失分析或者优化缺失分析。在某些实施方案中，方法和探针组可以提供下降的人为缺失发生率，例如分析经过人为截断的样品时。在某些实施方案中，方法和探针组可以区分小的和大的缺失。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于经荧光原位杂交检测肿瘤抑制基因缺失的方法、探针组和试剂盒本申请要求2010年3月15日提交的美国临时专利申请61/313，916和2010年3月15日提交的加拿大专利申请2，696，545的权益，两份申请的全部内容均通过引用并入本文。本专利技术涉及在检测肿瘤抑制基因的缺失的分析中使用的方法、探针组和试剂盒，以及制备所述探针组和优化所述分析的方法。本专利技术的实施方案还包括检测样品中的染色体事件，比如缺失、扩增、转位和其它染色体事件的方法，其中所述样品是比如血液或实体瘤以及甲醛固定石蜡包埋(FFPE)薄切片、细针抽吸活检(FNA)、抹片等。在某些实施方案中，染色体事件涉及诸如肿瘤抑制、癌基因相关的和/或原癌基因的基因。了解癌细胞或原癌细胞是否发生率肿瘤抑制基因的缺失对于提高诊断和/或预 后准确性或者治疗方法的选择一般来说很有用。被怀疑是癌细胞或原癌细胞的样品，比如来自怀疑是癌或原癌生长(包括肿瘤(081 ^1'、1^0 1&81118)、增生等)的样品经常以例如固定的保存样品(比如甲醛固定石蜡包埋(FFPE)样品)的形式供实验室分析。显然，这类样品的保存也使得可以进行追溯性研究，给未来预后和治疗选择提供信息。肿瘤抑制基因的缺失可以通过荧光原位杂交(FISH)在FFPE样品中检测分析，所述技术中样品与目标基因的探针以及通常还有至少一个对照探针和/或核复染进行接触。肿瘤抑制基因的例子包括PTEN、p53、pl6(又称为CDKN2A)、RBU DCC、BRCAU BRCA2和APC。可以利用荧光使探针可见，并且分析产生的FISH信号来确定是否存在缺失。来自实体生长物的样品以固定的保存样品提供时，通常是采取几个微米厚的切片。因此，在样品切片过程中有可能切掉了含有肿瘤抑制基因的那部分细胞核。这种现象经常造成核截断现象，导致实际上不带有肿瘤抑制基因缺失的细胞看上去至少失去了一个拷贝的肿瘤抑制基因。截断现象可能发生在间期细胞，这时染色体凝集并分布在构成常规病理学组织切片的球形核的三维空间内。在分裂中期细胞中广46条染色体处于扁平、杆状的线性结构，一般可以在不被截断的情况下沉积到显微镜载片的表面。在临床样品(包括来自疑似癌或原癌实体生长的样品，比如实体瘤)中，多数细胞的确通常处于间期。代表性的分裂中期细胞样品很难或者不可能从用于追溯性分析的样品，或者从患者中获得，固定、保存并送到异地实验室进行分析。因此核截断现象负面影响基于FISH的肿瘤抑制基因缺失分析的表现。为了防止假阳性(即发生了肿瘤抑制缺失的不正确结论)的可能性，可以给表观缺失发生率设置一个最低阈值，其中当表观缺失发生率不超过该阈值时，结果被认为是阴性或最多不确定的。所述阈值可以基于利用对照细胞估计的人为缺失发生率；观察到的缺失水平要被认为是显著的，可能需要超过人为缺失发生率例如人为缺失发生率的三个标准差。但是使用这种最小阈值要以灵敏度为代价，因为例如当样品中含有缺失的细胞的数量较低或者当样品中细胞是遗传型异质的时，很难或者不可能确定缺失。同源性憐酸酶-张力蛋白(phosphataseand tensin homolog, PTEN)是人体中由PTEN基因编码的一种蛋白质。许多癌症类型(Cristofano AD et al.，PTEN isessential for embryonic development and tumour suppression, NatureGenetics1998; 19:348-355)和被称为考登综合征(Cowden syndrome)的遗传学发育缺陷(MarshDJ et al. , Germline PTEN mutations in Cowdensyndrome-Iike families, J. Med.Genet. 1998;35:881-885)中观察到过该肿瘤抑制基因的失活。近年来，利用与PTEN杂交的368kb探针发现PTEN基因座周围368kb或以上的基因组缺失在前列腺癌中很常见(Yoshimoto et al. , Cancer Genetics and Cytogenetics 2006;169:128-137),并且它们的存在带来不利的预后(Yoshimoto et al. , British Journal of Cancer2007;97:678-685;Yoshimoto et al. ,Modern Pathology 2008;21:1451-1460)。因此，准确的肿瘤抑制基因(比如PTEN)缺失的分析法在临床上有重要意义。此外，需要更高的通过大小来区分缺失的检测能力。有纯合PTEN缺失的前列腺肿瘤，其中至少一个缺失事件删除了超过PTEN及其直接的周边的染色体区域，更有可能是转移性肿瘤或者发生转移的可能性增加。因此，用于这类检测的探针组和方法对预后和做出治疗方面的决定，以及对前列腺癌的进展和分类进行进一步研究是有用的。因此，需要用于检测肿瘤抑制基因(比如，例如PTEN)缺失分析的方法、探针组和试剂盒，所述分析能够减少核截断现象的发生率；以及制备这类探针组和优化所述分析的 方法。本专利技术的方法和组合物部分基于这样的发现，即通过提供能够减少误差(比如截断现象)来源的探针组可以使基于FISH的肿瘤抑制缺失分析的性能(特异性、灵敏度和/或统计学显著性)得以优化。所述探针组包含至少第一侧翼探针、目标探针和第二侧翼探针，它们分别与位于肿瘤抑制基因的着丝粒方向、肿瘤抑制基因或者附近，以及端粒方向的位点杂交。肿瘤抑制基因在某些类型的癌或原癌细胞中易于发生缺失；例如至少在前列腺肿瘤中PTEN很容易发生缺失。第一或第二侧翼探针和目标探针之间的距离在细胞遗传学尺度来说可能较短，例如，500kb-10或20Mb的距离。在某些实施方案中，第一和第二侧翼探针的杂交位点与目标探针的杂交位点分别被第一和任选的第二边界区隔开(例如，靠近这些部位的基因组结构特征，比如节段性重复和拷贝数差异；详细讨论见下文)。第一和第二侧翼探针的杂交位点可以分别位于第一和第二(如果有的话)边界区或者与所述区域从细胞遗传学角度来说邻近。所述探针组由于它们的杂交位点的位置，可以使基于FISH的基因变异分析的表现得以优化。将侧翼探针定位在目标探针的杂交位点附近和/或与边界区相邻，但相对边界区在分析目标的远端，可以起到减少不确定结果和/或包括由核截断造成的假阳性的人为观察结果的作用。因此，本公开提供了进行基于FISH的分析的方法，制备用于基于FISH的肿瘤抑制因子缺失分析的探针的方法，和测量核截断在基于FISH的肿瘤抑制因子分析中的影响的方法。本公开还提供了可以在基于FISH的肿瘤抑制因子缺失分析中使用的探针组和组合物以及包含所述探针的试剂盒。专利技术的一个实施方案是基于FISH的肿瘤抑制因子缺失分析中使用的探针组的制备方法，所述方法包括(a)识别染色体上的至少一个边界区，所述染色体包含肿瘤抑制基因，其中所述至少一个边界区包含位于肿瘤抑制基因着丝粒方向的第一边界区；(b)提供至少一个第一侧翼探针，所述探针与第一边界区内的核酸序列杂交；或者与相对第一边界区而言位于肿瘤抑制基因远端的核酸序列杂交；(c)提供至少一个第二侧翼探针，所述探针与位于本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：JA斯奎尔，M约希默托，
申请(专利权)人：金斯顿女王大学，金斯顿总医院，
类型：
国别省市：
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