马克斯克鲁维酵母转化体的制造方法技术

本发明专利技术的课题在于提供一种不使用特定的限制酶及其识别序列，而利用简单且有效地将DNA片段的末端联结起来的方法制造马克斯克鲁维酵母转化体的方法，以及使用该转化体的有用物质的制造方法等。由此，发现了下述解决手段：将不含马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列的二种以上的直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌，以通过所希望的DNA连接体表达的标记基因的表达为指标，选择包含所希望的DNA连接体的转化体，或者，将含有马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列的直链状的双链DNA片段单独导入或与一种以上的其它直链状的双链DNA片段组合导入马克斯克鲁维酵母菌，以通过所希望的DNA连接体表达的标记基因的表达为指标，选择包含所希望的DNA连接体的转化体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)转化体的制造方法、使用该转化体的有用物质的制造方法等。
技术介绍
联结DNA片段的末端制作任意DNA分子的技术，是以克隆为代表的众多分子生物学领域中的实验操作所必需的基本技术。目前，用于连接DNA片段的最常用的手段，是一种用DNA连接酶将具有平末端的DNA分子与分子之间，或具有互补的突出末端的DNA分子与分子之间结合起来的手段。并且，作为应用这种手段的克隆方法，已知Cohen-Boyer法(参见非专利文献I)，这种方法中，分别利用限制酶切断插入DNA和载体并提纯后，通过DNA连接酶使它们连接，制作目的构建体，通过该构建体转化大肠杆菌，使其扩增。但是，在利用限制酶和DNA连接酶的DNA连接方法上，若不是预先以使得末端互相适合的方式制备的DNA·分子，就无法连接，因此，为了制作转化用的构建体，Cohen-Boyer法需要将聚合酶链式反应(PCR)或限制酶处理等复杂的体外(in vitro)操作作为必要操作，并且，为了从转化后的大肠杆菌菌落中选出包含目的构建体的大肠杆菌，需要大量时间。由于上述原因，要求开发一种更为简便有效的DNA分子的连接方法。作为一种替代Cohen-Boyer法且不使用限制酶和DNA连接酶的克隆方法，已开发出了体外同源重组法和体内(in vivo)同源重组法。上述体外同源重组法是通过使用特定的重组酶和该酶的识别序列联结DNA分子的方法，已知有Invitrogen公司的Gateway法、TaKaRa Bio公司的In-Fusion克隆法等。但是，由于在这些方法中，需要在插入DNA的两端及载体上存在特定的DNA序列，因此，这些方法不能说是通用性好的方法。此外，作为上述的体内同源重组法，已知使用大肠杆菌(参见非专利文献2和3)和使用面包酵母的方法(参见非专利文献4和5)。这些体内同源重组法，是利用了表达来自噬菌体的多种蛋白质的大肠杆菌菌株或面包酵母具有极高的同源重组功能这一特性的方法。具体而言，通过制备在插入DNA的两端添加了与克隆载体同源的序列的插入DNA及用限制酶等切断了同源重组发生部分的克隆载体，并对大肠杆菌或面包酵母进行转化，由此可使得该转化细胞内(体内)发生同源重组，获得插入了插入DNA的克隆载体。由于这种反应的发生与限制酶位点无关，因此，在载体序列中的各种位置均可插入DNA片段。而且，由于插入DNA的长度，该方法还具有克隆效率不变的特点。但是，任一方法都是利用了同源重组的方法，因此，有必要向插入DNA添加与载体同源的序列。而且，对于使用了大肠杆菌的体内同源重组法而言，为了获得高的转化效率，有需要进行电穿孔且由于此操作而需要昂贵的装置和器具等缺点。此外，对于使用面包酵母的体内同源重组法而言，由于在大量制备DNA时要将克隆载体转移至大肠杆菌，因此，需要使用面包酵母-大肠杆菌穿梭载体。但是，面包酵母-大肠杆菌穿梭载体并非通常使用的载体，其制备费时费力。此外，作为不使用限制酶和DNA连接酶，而进行环状DNA构筑和扩增的方法，已知有使用通过滚环扩增法(rolling cycle)得到的直链DNA转化原核细胞,并在该转化细胞内再构筑环状DNA的方法(参见专利文献I)。但是，通过滚环扩增法制作的扩增DNA片段具有包含重复序列的特殊构造，尚不明确该方法是否能够应用于不包含重复序列的DNA片段的环状化。专利文献I :日本特开2005-229950号公报非专利文献I Cohen SN et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 70，3240-3244 (1973)非专利文献2 =Zhang Y et al.，Nat Genet. 20，123-128(1998)非专利文献3 Yu D et al. , Proc Natl Acad Sci USA. 97，5978-5983 (2000)非专利文献4 :Marykwas DL and Passmore SE, Proc Natl AcadSci USA. 92,11701-11705(1995) 非专利文献5 :01denburg KR et al. , Nucleic Acids Res. 25,451-452 (1997)
技术实现思路
本专利技术的课题在于提供不使用特定的限制酶及其识别序列，简便且有效地联结DNA片段的末端来制造马克斯克鲁维酵母转化体的方法，以及使用该转化体的有用物质的制造方法。到目前为止本专利技术人等已经证实，作为一种酵母的马克斯克鲁维酵母菌具有其它酵母所未被观察到的多种优异的性质(PCT/JP2007/001270、PCT/JP2009/001214)。而且，在进行涉及马克斯克鲁维酵母菌的转化方法的研究的过程中已表明不含有同源序列的直链状DNA被有效地并入了马克斯克鲁维酵母菌的基因组DNA中(NonklangS. et al. ApplEnviron Microbiol 74:7514-7521(2008))。从这些研究成果，本专利技术人等考虑是否可以将马克斯克鲁维酵母菌作为分子生物学研究的新工具来使用，于是，尝试了使用马克斯克鲁维酵母菌来进行新的DNA片段结合方法的开发。首先，将含有URA3基因的从转录起始密码子ATG的A到+771的序列的DNA片段和含有URA3基因的从+772到终止密码子的序列的DNA片段导入为尿嘧啶营养缺陷型突变株的马克斯克鲁维酵母RAK3605，并使用尿嘧啶缺陷型培养基进行了培养。结果证明，可高效地获得联结了导入的DNA片段的DNA连接体含在基因组DNA中的转化体。而且，本专利技术人等尝试进行了对此前未知的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(ARS)的鉴定，确定了序列号I 5所示的新ARS序列，同时发现通过将含有该ARS序列的直链状DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌中，可制作环状DNA连接体，由此完成了本专利技术。也就是说，本专利技术涉及(I) 一种包含含有二种以上的直链状的双链DNA片段的DNA连接体的转化酵母的制造方法，其特征在于依次包括步骤(a)和步骤(b)，其中，(a)为将不含自主复制序列的二种以上的直链状双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌的步骤，上述二种以上的直链状的双链DNA片段是下述二种以上的直链状的双链DNA片段，各双链DNA片段单独时不含有标记基因的表达所需的全部序列，而只有当多条双链DNA片段连接而形成了所希望的DNA连接体时，才含有使标记基因的表达成为可能的序列；(b)为以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、上述所希望的DNA连接体被插入到基因组DNA中的转化体的步骤，(2) 一种包含含有I种直链状的双链DNA片段的环状DNA连接体的转化酵母的制造方法，其特征在于依次包括步骤(a)和(b)，其中，(a)为将含有全部自主复制序列且含有标记基因的表达所需的全部序列的I种直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌中的步骤；(b)为以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、所希望的环状DNA连接体的步骤，(3) —种包含含有二种以上的直链状的双链DNA片段的环状DNA连接体的转化酵母的制造方法，其特征在于依次包括步骤(a)和(b)，其中，(а)为将含有全部自主复制序列且含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：赤田伦治，星田尚司，B·M·A·阿布德尔巴纳特，浅川润，
申请(专利权)人：国立大学法人山口大学，
类型：
国别省市：