高纯度可溶性血栓调节蛋白及其制造方法技术

本发明专利技术涉及高纯度可溶性血栓调节蛋白，其为由转化细胞所产生的可溶性血栓调节蛋白，该转化细胞是将包含编码可溶性血栓调节蛋白的碱基序列的DNA转染至宿主细胞而得到的，其中，宿主细胞来源的蛋白质含量比率为相对于10,000U可溶性血栓调节蛋白小于10ng。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高纯度可溶性血栓调节蛋白及其制造方法
本专利技术涉及高纯度可溶性血栓调节蛋白及其制造方法。
技术介绍
血栓调节蛋白作为具有通过与凝血酶特异性结合来阻断凝血酶的血液凝固活性并同时显著促进凝血酶的蛋白质C活化能力的作用的物质而为人所知，并已知其具有强力的血液凝固阻断作用。已知其延长基于凝血酶作用的凝固时间、抑制基于凝血酶的血小板聚集。蛋白质C为在血液凝固纤溶系统中起到重要作用的维生素K依赖性蛋白质，在凝血酶的作用下被活化，成为活化蛋白C。已知该活化蛋白C在生物体内使血液凝固系统因子的活性型第V因子以及活性型第VIII因子失活，并且还与具有血栓溶解作用的纤溶酶原激活剂的产生相关(非专利文献1)。因此认为，血栓调节蛋白利用该凝血酶来促进蛋白质C的活化，作为抗血液凝固剂或血栓溶解剂是有用的，另外还有动物实验报告指出血栓调节蛋白在伴随凝固亢进的疾病的治疗、预防中是有效(非专利文献2)。以往，血栓调节蛋白是作为在以人为首的各种动物种的血管内皮细胞上表达的糖蛋白质而被发现获得的，其后成功进行克隆化。即，利用基因工程方法，从人肺cDNA文库中对含有信号肽的人血栓调节蛋白前体的基因进行克隆，并且对血栓调节蛋白的全基因序列进行解析，明确了含有信号肽(通常示例出18个氨基酸残基)的575个残基的氨基酸序列(专利文献1)。信号肽被切断的成熟血栓调节蛋白由以下5个区域构成：从其成熟肽的N末端侧起的N末端区域(1-226号：表示在认可信号肽为18个氨基酸残基时的位置，下同)、具有6个EGF样结构的区域(227-462号)、O型糖链增加区域(463-498号)、膜贯通区域(499-521号)、以及细胞质内区域(522-557号)，并且作为与全长血栓调节蛋白具有相同活性的部分(即最小活性单元)，已知为在具有6个EGF样结构的区域之中的主要由从N末端侧起的第4、5、6号EGF样结构构成的部分(非专利文献3)。全长的血栓调节蛋白如果没有表面活性剂的存在则难以溶解，作为制剂必须添加表面活性剂，与此相对，存在即使在没有表面活性剂的情况下也能很好地发生溶解的可溶性血栓调节蛋白。只要使可溶性血栓调节蛋白至少不含有膜贯通区域的一部分或全部来进行制备即可，例如，仅由N末端区域、具有6个EGF样结构的区域和O型糖链增加区域这3个区域构成(即，由序列编号1的第19～516位氨基酸序列构成)的可溶性血栓调节蛋白可通过应用重组技术来获得，并且确认到该重组体可溶性血栓调节蛋白具有天然的血栓调节蛋白的活性(专利文献1)。此外作为可溶性血栓调节蛋白的例子也有一些报告(专利文献2～9)。另外作为天然型也举出了人尿来源的可溶性血栓调节蛋白等(专利文献10、11)。顺便提及，在基因中，通过自然的变异或取得时的变异，如多数情况所确认的那样，在人中也发现了多形性变异，上述的由575个残基的氨基酸序列构成的人血栓调节蛋白前体的第473位氨基酸为Val的和为Ala的是现在所确认的。在编码该氨基酸的碱基序列中，分别相当于在第1418位上有T变异和C变异(非专利文献4)。但是，在活性和物性方面是完全无差异的，可判定两者实质上相同。有报告指出血栓调节蛋白在DIC的治疗中是有效的(非专利文献5、6)。作为血栓调节蛋白的用途，除了上述以外，还期待其用于例如下述疾病的治疗和预防：急性冠状动脉综合征(ACS)、血栓症、末梢血管闭塞症、闭塞性动脉硬化症、血管炎、心脏手术的继发性功能性障碍、脏器移植的并发症、心绞痛、暂时性脑缺血发作、妊娠中毒症、糖尿病、肝VOD(Liverveno-occlusivedisease；急性肝炎和骨髓移植后的肝静脉闭塞症)、深部静脉血栓症(DVT；Deepvenousthrombosis)等；以及成人呼吸窘迫综合症(ARDS；Adultrespiratorydistresssyndrome)。以考虑到在药品中的应用为前提，需要大量地且以更低成本来制造可溶性血栓调节蛋白，这自不消说，但有文献指出，来源于制造工序的异种蛋白质(例如宿主细胞来源的蛋白质、培养基来源的牛血清蛋白、抗体柱来源的小鼠IgG等)具有免疫原性，从安全性方面考虑可能有问题(非专利文献7)。考虑到在药品中的应用，作为以工业水平制造可溶性血栓调节蛋白的方法，例如已知有采用担载有针对血栓调节蛋白的抗体的亲和柱色谱法作为主精制工序的方法；进一步已知有下述高纯度可溶性血栓调节蛋白的制造方法，其为实质上不含有血清来源物和抗体来源物的高纯度可溶性血栓调节蛋白的制造方法，该制造方法的特征在于，将通过亲和色谱法得到的该可溶性血栓调节蛋白在电导率为25ms/cm～34ms/cm、pH为3～4的条件下与阳离子交换体接触，在该工序中，以流通级分(素通り画分)的形式得到该可溶性血栓调节蛋白(专利文献12)。还已知有在主精制工序的亲和柱色谱法工序之后组合强阴离子交换柱色谱法的精制方法(专利文献13)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开昭64-6219号公报专利文献2：日本特开平2-255699号公报专利文献3：日本特开平3-133380号公报专利文献4：日本特开平3-259084号公报专利文献5：日本特开平4-210700号公报专利文献6：日本特开平5-213998号公报专利文献7：WO92/00325号公报专利文献8：WO92/03149号公报专利文献9：WO93/15755号公报专利文献10：日本特开平3-86900号公报专利文献11：日本特开平3-218399号公报专利文献12：日本特开平11-341990号公报专利文献13：WO2008/117735号公报非专利文献非专利文献1：铃木宏治，医学のあゆみ(医学进展)，第125卷，901页(1983年)非专利文献2：K.Gomi等，Blood75.1396-1399(1990)非专利文献3：M.Zushi等，J.Biol.Chem.,264,10351-10353(1989)非专利文献4：D.Z.Wen等，Biochemistry,26,4350-4357(1987)非专利文献5：S.M.Bates等，Br.J.Pharmacol.,144,1017-1028(2005)非专利文献6：H.Saito等，J.ThrombHaemost,5(1),31(2007)非专利文献7：早川堯夫，バイオ医薬品の開発と品質·安全性確保(生物药品的开发与品质-安全性确保)，273-274(2007)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于提供宿主细胞来源的蛋白质浓度比率为相对于10,000U可溶性血栓调节蛋白小于10ng的高纯度可溶性血栓调节蛋白及其制造方法。解决课题的手段在专利文献13中记载了经精制的可溶性血栓调节蛋白。特别是在该文献的实施例14中公开了宿主来源的蛋白质(以下，在本说明书中也简称为“HCP”)的浓度被记为“N.D.”(尽管未明确记载，但认为其意味着“未检出”)的可溶性血栓调节蛋白。看到该记载的本领域技术人员会认为已经充分实现了HCP的混入得以降低的高纯度可溶性血栓调节蛋白，也就不会想到试图降低可溶性血栓调节蛋白中的HCP，即试图降低可溶性血栓调节蛋白中HCP的混入的动机等通常是不存在的。但是，本专利技术人强烈认识到如下重大问题：在将精制的可溶性血栓调节蛋白作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.30 JP 2010-1054211.一种高纯度可溶性血栓调节蛋白，其为由转化细胞所产生的可溶性血栓调节蛋白，该转化细胞是将编码可溶性血栓调节蛋白的碱基序列的DNA转染至宿主细胞而得到的，其中，宿主细胞来源的蛋白质含量比率为相对于10,000U可溶性血栓调节蛋白小于10ng且为0.001ng以上，该宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。2.如权利要求1所述的高纯度可溶性血栓调节蛋白，其中，可溶性血栓调节蛋白为通过对该转化细胞进行无血清培养而产生的可溶性血栓调节蛋白。3.如权利要求1或2所述的高纯度可溶性血栓调节蛋白，其中，该可溶性血栓调节蛋白为具有下述(1)～(5)的性质的可溶性血栓调节蛋白：(1)与凝血酶选择性结合的作用；(2)促进基于凝血酶的蛋白质C的活化的作用；(3)延长基于凝血酶的凝固时间的作用；(4)抑制基于凝血酶的血小板聚集的作用；以及(5)抗炎作用。4.如权利要求1或2所述的高纯度可溶性血栓调节蛋白，其中，该可溶性血栓调节蛋白的分子量为50,000至80,000的范围。5.如权利要求1或2所述的高纯度可溶性血栓调节蛋白，其中，该高纯度可溶性血栓调节蛋白是通过包括以下工序的方法制造的：(a)将编码可溶性血栓调节蛋白的碱基序列的DNA转染至宿主细胞，获得转化细胞的工序；(b)培养该转化细胞，获得含有可溶性血栓调节蛋白的溶液的工序；以及(c)使该含有可溶性血栓调节蛋白的溶液与尼龙和/或聚醚砜接触，得到高纯度可溶性血栓调节蛋白的工序，该高纯度可溶性血栓调节蛋白中，宿主细胞来源的蛋白质含量比率为相对于10,000U可溶性血栓调节蛋白小于10ng。6.如权利要求1或2所述的高纯度可溶性血栓调节蛋白，其中，该可溶性血栓调节蛋白为下述可溶性血栓调节蛋白：其为序列编号9或序列编号11的任一项所记载的氨基酸序列中的第19～516位氨基酸序列的肽。7.如权利要求1或2所述的高纯度可溶性血栓调节蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：上野雄二，重松弘树，
申请(专利权)人：旭化成制药株式会社，
类型：
国别省市：