PCR用引物对、PCR用反应液以及食物中毒菌的检测方法技术

一种PCR用引物对，其特异性扩增蜡样芽孢杆菌、弯曲菌、大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌中的两种以上的食物中毒菌的核酸。由此，可以同时且特异性地检测出这些食物中毒菌。使用由如下引物对之中的两个以上的引物对组成的PCR用引物对，利用PCR法，对食物中毒菌的核酸进行特异性扩增，所述引物对包括：用于蜡样芽孢杆菌检测的序列编号1和2、序列编号3和4的引物对；用于弯曲菌检测的序列编号5和6的引物对；用于大肠杆菌检测的序列编号7和8的引物；用于李斯特菌检测的序列编号9和10的引物对、用于沙门氏菌检测的序列编号11和12的引物对；用于金黄色葡萄球菌检测的序列编号13和14的引物对；用于副溶血弧菌检测的序列编号15和16的引物对。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于检测食物中毒菌的PCR用引物对，特别是涉及能够特异性地检测多种食物中毒菌的PCR用引物对、PCR用反应液、食物中毒菌的检测方法。
技术介绍
以往，在食品检查或环境检查、临床试验、家畜卫生等方面上，进行是否存在食物中毒菌的检查。在这样的检查中，近年来进行如下操作利用PCR(聚合酶链反应)，将检查试样中所包含的DNA(脱氧核糖核酸)扩增，并基于所得到的扩增产物，判定对象菌。 当进行这样的PCR时，设计能够特异性地扩增对象菌的引物为重要。于是，在专利文献I中，公开了能够检测出如下五种食物中毒菌的引物对肠管出血性大肠杆菌0157、沙门氏菌、弯曲菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌群。此外，在专利文献2中，公开了用于如下目的的引物对使用LAMP法(环介导等温扩增技术，Loop-Mediated Isothermal Amplification)来扩增沙门氏菌 04 群的 DNA。专利文献I :日本特开2007-274934号公报专利文献2 :日本特开2008-72951号公报
技术实现思路
专利技术要解决的课题然而，用这些方法不能检测出其他的食物中毒菌。在细菌性食物中毒中，还多有由蜡样芽孢杆菌或副溶血弧菌引起的情况，包括大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、弯曲菌、金黄色葡萄球菌的五种与蜡样芽孢杆菌和副溶血弧菌的七种食物中毒菌占引起细菌性食物中毒疾病的原因的90%以上。因此，如果能够同时且分别特异性地检测出这些七种食物中毒菌是否存在于食品或环境等中，则非常有用。此处，当存在多种食物中毒菌时,为了分别特异性地检测出这些食物中毒菌,需要设计能够同时扩增该多种食物中毒菌的DNA的一部分的引物对。此时，不得因不同的对象区域的引物对的引物的组合而扩增非对象区域。此外，当存在多个不同的对象区域引物对时，如果引物的长度或熔解温度等相似，则有时进行竞争，因此，需求设计能够进行与单一情况相比特异性更高的扩增的引物。如此，分别特异性地检测出多种食物中毒菌是非常困难的，至今认为，特异性地检测出食物中毒菌五种为限，无法检测出五种以上的多种食物中毒菌。于是，本专利技术人进行了深入研究，反复进行了多次实验，结果成功地开发出，能够以上述七个菌种中的八个区域的毒素区域基因或生物体内必须基因为对象、分别特异性地扩增这些基因的多重PCR用引物对，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术的目的在于提供能够特异性地扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),弯曲菌(Campylobacter 属)、大肠杆菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria 属)、沙门氏菌(Salmonella属)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的两种以上的食物中毒菌的PCR用引物对、PCR用反应液、食物中毒菌的检测方法、以及引物的设计方法。用于解决课题的手段本专利技术的PCR用引物对PCR用引物对是用于通过PCR法来扩增核酸的引物对，其由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对混合而成，所述引物对包括第一引物对，具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号I所示的碱基序列组成的引物和由序列编号2所示的碱基序列组成的引物；第二引物对，具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号3所示的碱基序列组成的引物和由序列编号4所示的碱基序列组成的引物；第三引物对,具备用于扩增弯曲菌(Campylobacter属)的DNA的、由序列编号5所不的喊基序列组成的引物和由序列编号6所不的喊基序列组成的引物；第四引物对，具备用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列编号7所示的碱基序列组成的引物和由序列编号8所示的碱基序列组成的引物；第五引物对，具备用于扩增李斯特菌(Listeria属)的DNA的、由序列编号9所示的碱基序列组成的引物和由序列编号10所示的碱基序列组成的引物；第六引物对，具备用于扩增沙门氏菌(Salmonella属)的DNA的、由序列编号11所不的喊基序列组成的引物和由序列编号12所不的喊基序列组成的引物；第七引物对，具备用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列编号13所不的喊基序列组成的引物和由序列编号14所不的喊基序列组成的引物；以及第八引物对，具备用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列编号15所不的喊基序列组成的引物和由序列编号16所不的喊基序列组成的引物。另外，本专利技术的PCR用引物对是用于通过PCR法来扩增核酸的引物对，其由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对混合而成，所述引物对包括以蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因(nhe)为扩增对象区域的引物对、以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的呕吐毒素合成酶基因(cesB)为扩增对象区域的引物对、以弯曲菌(Campylobacter属)的基因组DNA中所包含的核糖体基因(16S rDNA)为扩增对象区域的引物对、以大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组DNA中所包含的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)为扩增对象区域的引物对、以李斯特菌(Listeria属)的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(dnaj)为扩增对象区域的引物对、以沙门氏菌(Salmonella属)的基因组DNA中所包含的侵袭性因子相关基因(invA)为扩增对象区域的引物对、以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因(dnaj)为扩增对象区域的引物对、以及以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的基因组DNA中所包含的耐热性溶血毒素基因(tdh)为扩增对象区域的引物对。此外，本专利技术的PCR用反应液含有上述PCR用引物对。此外，本专利技术的食物中毒菌的检测方法是使用由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对，在利用PCR法的扩增对象的试样中包含对应于这些引物对的一个或两个以上的食物中毒菌的核酸时，特异性地扩增该核酸，并基于所得到的扩增产物，检测食物中毒菌的方法，所述引物对包括第一引物对，具备用于扩增腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号I所不的喊基序列组成的引物和由序列编号2所不的喊基序列组成的引物；第二引物对，具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号3所示的碱基序列组成的引物和由序列编号4所示的碱基序列组成的引物；第三引物对，具备用于扩增弯曲菌(Campylobacter属)的DNA的、由序列编号5所示的碱基序列组成的引物和由序列编号6所示的碱基序列组成的引物；第四引物对，具备用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列编号7所示的碱基序列组成的引物和由序列编号8所示的碱基序列组成的引物；第五引物对，具备用于扩增李斯特菌(Listeria属)的DNA的、由序列编号9所不的喊基序列组成的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.14 JP 2010-0933161.ー种PCR用引物对，其用于通过PCR法来扩增核酸，其特征在于，由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对混合而成，所述引物对包括 第一引物对具备用于扩增腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号I所不的喊基序列组成的引物和由序列编号2所不的喊基序列组成的引物； 第二引物对具备用于扩增蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA的、由序列编号3所不的喊基序列组成的引物和由序列编号4所不的喊基序列组成的引物； 第三引物对具备用于扩增弯曲菌(Campylobacter属)的DNA的、由序列编号5所示的喊基序列组成的引物和由序列编号6所不的喊基序列组成的引物； 第四引物对具备用于扩增大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的、由序列编号7所不的喊基序列组成的引物和由序列编号8所不的喊基序列组成的引物； 第五引物对具备用于扩增李斯特菌(Listeria属)的DNA的、由序列编号9所示的碱基序列组成的引物和由序列编号10所不的喊基序列组成的引物； 第六引物对具备用于扩增沙门氏菌(Salmonella属)的DNA的、由序列编号11所不的喊基序列组成的引物和由序列编号12所不的喊基序列组成的引物； 第七引物对具备用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA的、由序列编号13所不的喊基序列组成的引物和由序列编号14所不的喊基序列组成的引物；以及第八引物对具备用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNA的、由序列编号15所不的喊基序列组成的引物和由序列编号16所不的喊基序列组成的引物。2.根据权利要求I所述的PCR用引物对，其特征在干， 所述引物对是将所述第一至第八的所有的引物对混合而成的。3.根据权利要求I或2所述的PCR用引物对，其特征在干， 所述第一至第八引物对中的引物为以下的(A)或(B) (A)在序列编号I 16所示的碱基序列中I个或几个碱基被缺失、置换或增加而成的引物、 (B)由能够在严格条件下与如下核酸片段杂交的核酸片段组成的引物，所述核酸片段由与序列编号I 16所示的碱基序列互补的碱基序列組成。4.ー种PCR用引物对，其特征在于， 由具有与权利要求I 3中任一项所述的PCR用引物对互补的碱基序列的引物组成。5.ー种PCR用引物对，其用于通过PCR法来扩增核酸，其特征在于，由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对混合而成，所述引物对包括 以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的不显示溶血活性的肠毒素分泌基因nhe为扩增对象区域的引物对、 以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA中所包含的呕吐毒素合成酶基因cesB为扩增对象区域的引物对、 以弯曲菌(Campylobacter属)的基因组DNA中所包含的核糖体基因16S rDNA为扩增对象区域的引物对、 以大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组DNA中所包含的尿苷单磷酸激酶基因pyrH为扩增对象区域的引物对、 以李斯特菌(Listeria属)的基因组DNA中所包含的热休克蛋白基因dnaj为扩增对象区域的引物对、 以沙门氏菌(Salmonella属)的基因组DNA中所包含的侵袭性因...

【专利技术属性】
技术研发人员：山崎隆明，原田天章，猿渡由宽，龟井修一，
申请(专利权)人：东洋制罐株式会社，东洋钢钣株式会社，
类型：
国别省市：