L-苏氨酸的分析方法和L-苏氨酸脱氢酶技术

本发明专利技术提供了包含在被分析物中的L-苏氨酸的分析方法，将含有被分析物的样品与来源于钩虫贪铜菌（Cupriavidus?necator）的L-苏氨酸脱氢酶以及辅酶NAD+混合，经过预定的时间后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量；可用于该分析方法中的新型L-苏氨酸脱氢酶（TDH；EC?1.1.1.103）——来源于钩虫贪铜菌（Cupriavidus?necator）的L-苏氨酸脱氢酶；用于制备该酶的基因等和酶的制备方法；还提供了包括（A）上述L-苏氨酸脱氢酶和（B）辅酶NAD+的用于分析L-苏氨酸脱氢酶的试剂盒，其是在缓冲液中含有上述L-苏氨酸脱氢酶且用于分析L-苏氨酸脱氢酶的酶制品；使用上述L-苏氨酸脱氢酶的酶传感器。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及L-苏氨酸的分析方法和可用于该分析方法中的L-苏氨酸脱氢酶。
技术介绍
L-苏氨酸是必需氨基酸，必须从食物中获取。L-苏氨酸对于保持体内的氮平衡是必需的，并促进正常的生长发育。此外，它对于保持心血管、肝脏、中枢神经、肠、免疫系统的功能也有作用。 由于缺乏维生素B12、II型瓜氨酸血症、败血症、氨基酸或氮失衡，可导致血液中的苏氨酸含量不足。此外，素食主义者由于食用缺少苏氨酸含量的谷类，可以导致苏氨酸不足。对于各种疾病或先天性代谢异常的诊断、患者的长期营养补充、氨基酸代谢异常疾病的相关研究等而言，L-苏氨酸的定量是必须的。已报道过多种L-苏氨酸的定量方法。通过四乙酸铅使苏氨酸变为乙醛，用浓聚硫酸吸收，检测乙醛与对羟基联苯缩合的色素，来测量蛋白质水解产物、明胶、血清中的苏氨酸，可以通过HPLC、质谱、氨基酸分析装置等定量。这些方法存在操作危险，需要多个步骤，使用昂贵的仪器，不适合操作多个样品的大规模筛选方法的问题。作为酶学手段，有使用苏氨酸脱氨酶(EC 4.2. I. 16)的方法。报道了该酶将L-苏氨酸分解为α-酮基丁酸和氨，所生成的α-酮基丁酸变成腙衍生物的方法(非专利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.04 JP 2010-0481931.被分析物中包含的L-苏氨酸的分析方法，其中，将含有被分析物的样品与来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的L-苏氨酸脱氢酶或者具有下述(I) - (3)中的任ー氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质以及辅酶NAD+混合，经过预定的时间后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量， (1)序列表的序列号I记载的氨基酸序列； (2)在序列表的序列号I记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f30个氨基酸而得到的氨基酸序列； (3)相对于序列表的序列号I记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。2.权利要求I记载的分析方法，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。3.权利要求I或2记载的分析方法，其中，所述NADH的量的分析是通过測定340nm处的吸光度(A340 )、色素生成、或变换为荧光来进行的。4.权利要求I或2记载的分析方法，其中，所述2-氨基-3-氧代丁酸的量的分析是通过将自2-氨基-3-氧代丁酸生成的氨基丙酮用单胺氧化酶氧化，并测定所产生的氨或过氧化氢来进行的。5.来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶。6.权利要求5记载的L-苏氨酸脱氢酶，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。7.具有下述(I)- (3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质 (1)序列表的序列号I记载的氨基酸序列； (2)在序列表的序列号I记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加f30个氨基酸而得到的氨基酸序列； (3)相对于序列表的序列号I记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。8.来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶，其具有以下物理性质和特性 分子量(SDS-PAGE) 79400 亚基分子量(SDS-PAGE) 37200最适 pH 10. O 最适温度75°C 底物特异性仅对L-苏氨酸显示出活性 辅酶NAD+ (对NADP+为非活性) 抑制剂被碘こ酰胺、PMS、NEM抑制。9.编码权利要求7记载的蛋白质的基因。...

【专利技术属性】
技术研发人员：浅野泰久，T尤特农奇特，
申请(专利权)人：富山县，味之素株式会社，
类型：
国别省市：