铜绿假单胞菌B血清型脂多糖的抗体制造技术

本发明专利技术提供对铜绿假单胞菌具有优异抗菌活性的新型抗体。通过使用从具有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者得到的成浆细胞作为初始材料，成功得到与B血清型铜绿假单胞菌株的LPS结合且在体内和体外具有优异抗菌活性的抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及铜绿假单胞菌B血清型脂多糖的抗体及其应用。更具体地，本专利技术涉及特异性结合铜绿假单胞菌株B血清型脂多糖的抗体，以及含有任何该抗体的药物组合物、铜绿假单胞菌感染诊断剂和铜绿假单胞菌检测试剂盒。
技术介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是广泛且主要分布于自然环境如土壤和水中的革兰氏阴性需氧杆菌。铜绿假单胞菌是通常不引起健康受试者致病的非致病细菌(avirulent bacterium),所述健康受试者对铜绿假单胞菌具有中度的抗体效价以及足够 的免疫功能。然而，一旦体弱患者感染铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌可引起严重症状，其可导致所述患者死亡。为此，铜绿假单胞菌作为医院感染和机会感染的主要病原菌引人瞩目，因此预防和治疗铜绿假单胞菌感染已经是医学领域的重要问题。为预防或治疗铜绿假单胞菌感染，已经主要使用抗生素或合成抗菌剂。然而，铜绿假单胞菌产生了对这些药物的抗药性，因此这种药物在许多情况下无法提供足够的治疗作用。特别地，使用抗生素等治疗耐多药铜绿假单胞菌(MDRP)的感染很难且有限制。为此，作为替代方法，已经开始进行使用免疫球蛋白制剂的治疗。同时，已经检验了使用铜绿假单胞菌的抗体预防或治疗铜绿假单胞菌感染。例如，已经开发了各自与特定血清型铜绿假单胞菌株特异性结合的抗体(专利文献1-5，以及非专利文献I和2)。然而，到目前为止开发的铜绿假单胞菌的抗体在铜绿假单胞菌感染的预防或治疗中尚无法提供足够的作用。引用列表专利文献专利文献I日本未审查专利申请公开号平6-178688专利文献2日本未审查专利申请公开号平6-178689专利文献3日本未审查专利申请公开号平7-327677专利文献4国际公开号W02004/101622专利文献5国际公开号W02006/084758非专利文献非专利文献IThe Journal of Infectious Diseases, 152，6，1985，1290-1299.非专利文献2Journal of General Microbiology, 133, 1987, 3581-3590.
技术实现思路
技术问题鉴于上述情况作出本专利技术，且本专利技术的一个目标是提供对铜绿假单胞菌具有优异抗菌活性的新型抗体。本专利技术的一个主要目标是提供与铜绿假单胞菌株B血清型脂多糖特异性结合的抗体。技术方案为实现上述目标，本专利技术采用以下方法。首先，从慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者和健康志愿者采集血液样本。借助如下手段鉴定具有高比例的对脂多糖(下文中有时简称为“LPS”)特异的成浆细胞的供体样本(I)测定血液循环中成浆细胞和浆细胞的量的FACS分析；(2)测定血液循环中细胞量的ELISP0T分析，所述细胞制造对特定LPS抗原特异的抗体；和(3)测定存在或不存在对特定LPS抗原特异的免疫球蛋白的ELISA分析。下一步，由所述鉴定的供体样本制备识别LPS的抗体。具体地，通过对⑶19、⑶38、λ-轻链和死细胞染色选择存活成浆细胞。在选出的成浆细胞上，通过包括多重重叠延伸RT-PCR和后续巢式PCR的两步PCR从相同B细胞获得编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的成对DNA序列(图I )。下一步，将扩增的DNA插入筛选载体，并随后转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中。从所述大肠杆菌纯化扩增载体的集合。将得到的抗体库在动物培养细胞中表达。通过ELISA筛选编码结合至纯化的LPS分子的抗体的克隆，并选出LPS特异的克隆。随后，测定所选出克隆的碱基序列。随后，对由这样得到的克隆所编码的抗体检测其各种活性、其血清型特异性和抗原表位。 作为结果，发现所确定的抗体与铜绿假单胞菌B血清型LPS结合，并在体外和体内具有优异抗菌活性。具体地，本专利技术涉及与铜绿假单胞菌B血清型LPS结合的抗体，其表现出优异的抗菌活性。本专利技术也涉及该抗体的用途。更具体地，本专利技术提供[I]识别铜绿假单胞菌脂多糖的B带LPS的抗体，其与B血清型铜绿假单胞菌株的表面充分结合，但不与A、C、D、E、F、G、H、I和M血清型铜绿假单胞菌株的表面的任一种充分结合。[2]根据第I条所述的抗体，其具有对B血清型铜绿假单胞菌株的调理素活性。[3]根据第2条所述的抗体，其中对ATCC 33349标识的铜绿假单胞菌株的调理素活性的EC50为5 μ g/ml或更少。[4]根据第2条所述的抗体，其中对ATCC 27578和ATCC BAA-47中的任一个标识的铜绿假单胞菌株的调理素活性的EC50为I μ g/ml或更少。[5]根据第I至4条的任一条所述的抗体，其具有对B血清型铜绿假单胞菌株的凝集活性。[6]根据第5条所述的抗体，其中对ATCC BAA-47标识的铜绿假单胞菌株的单位量(μ g) IgG的凝集效价为1000或更大。[7]根据第I至6条的任一条所述的抗体，其对B血清型铜绿假单胞菌株的全身性感染具有抗菌作用。[8]根据第7条所述的抗体，其中对全身性感染ATCC 27578标识的铜绿假单胞菌株的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的1/300。[9]根据第7条所述的抗体，其中对全身性感染ATCC BAA-47标识的铜绿假单胞菌株的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的1/100。[10]具有下列(a)和(b)特征任一个的抗体(a)包括包括记载于SEQ ID NO: I至3的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID No: I至3的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和包括记载于SEQ ID N0:4至6的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID N0:4至6的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区；(b)包括 包括记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和包括记载于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区。[11]具有下列(a)和(b)特征任一个的抗体(a)包括包括记载于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和包括记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID N0:8的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区；以及(b)包括包括记载于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和包括记载于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区。[12]含有抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽具有下列(a)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.18 JP 2010-0334291.一种抗体，其识别铜绿假单胞菌脂多糖的B带LPS，且与B血清型铜绿假单胞菌株的表面充分结合，但不与A、C、D、E、F、G、H、I和M血清型铜绿假单胞菌株表面的任何一种充分结合。2.根据权利要求I的抗体，其对B血清型铜绿假单胞菌株具有调理素活性。3.根据权利要求2的抗体，其中对ATCC33349标识的铜绿假单胞菌株的调理素活性的EC50为5μ g/ml或更少。4.根据权利要求2的抗体，其中对ATCC27578和ATCC BAA-47的任一者标识的铜绿假单胞菌株的调理素活性的EC50为I μ g/ml或更少。5.根据权利要求I至4中任一权利要求的抗体，其具有对B血清型铜绿假单胞菌株的凝集活性。6.根据权利要求5的抗体，其中单位量(μg) IgG对ATCC BAA-47标识的铜绿假单胞菌株的凝集效价为1000或更大.7.根据权利要求I至6中任一权利要求的抗体，其对B血清型铜绿假单胞菌株的全身性感染具有抗菌作用。8.根据权利要求7的抗体，其中对全身性感染ATCC27578标识的铜绿假单胞菌株的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮的1/300。9.根据权利要求7的抗体，其中对全身性感染ATCCBAA-47标识的铜绿假单胞菌株的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮的1/100。10.具有下列(a)和(b)特征任意之一的抗体 Ca)包括 包括记载于SEQ ID NO: I至3的氨基酸序列或包括记载于SEQID NO: I至3的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和 包括记载于SEQ ID N0:4至6的氨基酸序列或包括记载于SEQID N0:4至6的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区；和 (b)包括 包括记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和 包括记载于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 12至14的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区。11.具有下列(a)和(b)特征任意之一的抗体 Ca)包括 包括记载于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和 包括记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区；以及(b)包括 包括记载于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 15的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和 包括记载于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或...

【专利技术属性】
技术研发人员：田中二朗，P·S·安德森，奥富隆文，稻叶常良，大冢圭子，赤羽宏友，星名由佳利，长曽宏，熊谷正志，
申请(专利权)人：明治制果药业株式会社，西福根有限公司，
类型：
国别省市：