牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法技术

本发明专利技术属于基因工程和生物技术领域，公开一种牡蒿质膜Na+/H+逆向转运蛋白AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选方法，提供了SOS1s基因的重组载体、转化细胞、酵母突变体的转化及转化细胞的耐盐性分析。AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选：(1)SOS1s基因的克隆；(2)酵母表达载体pAG426GPD‑SOS1s的构建；(3)4个SOS1s酵母转化细胞的耐盐性分析；(4)AjSOS1耐盐关键氨基酸位点的筛选。通过定点突变产生一系列AjSOS1muts并回补酵母突变体ANT3，发现AjSOS1序列中耐盐关键氨基酸位点，为菊花及其近缘种属植物耐盐分子机理的研究提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程技术和生物
，涉及一种通过氨基酸定点突变和回补酵母突变体筛选目的基因关键氨基酸位点的方法，具体涉及包括有AjSOS1、CrcSOS1、CcSOS1和CmSOS1基因(统称SOS1s)的重组载体、酵母突变体的转化、4个SOS1s转酵母细胞的耐盐性分析、AjSOS1定点突变的产生及AjSOS1muts酵母转化细胞Na+转运能力差异的比较分析。
技术介绍
土壤盐渍化是影响农业生产中作物产量和品质的重要非生物胁迫之一。菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，用途和栽培地域极广，具很高的观赏和经济价值，在现代花卉生产中占有十分重要的地位。然而切花菊设施栽培中土壤次生盐渍化及我国大面积盐渍土是制约菊花生产与园林应用的主要因子，菊花及其近缘种属植物耐盐机理研究及耐盐优异基因挖掘是加快耐盐菊花新品种培育的基础。钠离子是盐土中的主要成分，植物中Na+的过量积累会扰乱细胞内的离子稳态，导致K+/Na+比率降低，膜电位消散，同时引起渗透胁迫和次生二级胁迫如氧化胁迫等，导致代谢酶活性和光合作用的减弱，从而使植物生长受到抑制，最终细胞死亡(Hasegawa等，2000；Tuteja等，2007；Zhu等，2001)。因此，在盐胁迫下，植物必须使细胞溶质内的Na+浓度最小化来抵御盐胁迫(Tester等，2003)。为了避免Na+在植株内的积累，植物逐渐形成了3种策略：1)限制Na+从土中进入植物根部；2)区域化Na+进入液泡；3)主动将Na+泵出细胞质(Apse等，2007；Munns等，2008；Rajendran等，2009)。多个离子转运体参与这些过程，其中最为显著的代表是Na+/H+反向转运体。迄今为止，研究最为清楚的两类Na+/H+反向转运体为NHE/NHX和NhaP/SOS1(Pardo等，2006；Tester等，2003)。质膜型Na+/H+逆向转运蛋白SOS1是一个Na+外排蛋白，参与Na+从细胞溶质中的排出和木质部长距离运输(Oh等，2009；Olias等，2009；Shi等，2000；Shi等，2002)。拟南芥AtSOS1的克隆促进了多个物种细胞质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离和研究。近年来已有很多关于不同植物来源SOS1基因功能特性的研究，其中酵母缺失Na+转运系统突变体中的异源表达已被成功用于鉴定和明确基因功能且是一种简单有效的了解植物蛋白特性的方法(Garciadeblás等，2007；Martínez-Atienza等，2007；Oh等，2009；Quintero等，2002；Takahashi等，2009；Tang等，2010；Xu等，2008)。在菊花极其近缘种属植物耐盐性的评价及耐盐机理研究方面，管志勇等(2010)以叶片形态为依据对菊花近缘种属32份种质的耐盐性进行了鉴定，发现芙蓉菊、牡蒿耐盐性极强；大岛野路菊耐盐性强；栽培菊花‘神马’对盐胁迫敏感等具有不同耐盐性的植物材料(管志勇等，2010)。但是目前关于这些植物材料的耐盐性分子机理的研究报道相对较少。参考文献：ApseMP,BlumwaldE.(2007).Na+transportinplants.FEBSLetters,581(12),2247-2254.GarciadeblásB,HaroR,BenitoB.(2007).CloningoftwoSOS1transportersfromtheseagrassCymodoceanodosa.SOS1transportersfromCymodoceaandArabidopsismediatepotassiumuptakeinbacteria.Plantmolecularbiology,63(4),479-490.HasegawaPM,BressanRA,ZhuJK,BohnertHJ.(2000).PlantcellularandmolecularresponsestohighSalinity.AnnualReviewsofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,51(1),463-99.Martínez-AtienzaJ,JiangX,GarciadeblasB,MenDozaI,ZhuJK,PardoJM,QuinteroFJ.(2007).Conservationofthesaltoverlysensitivepathwayinrice.PlantPhysiology,143(2),1001-1012.MunnsR,TesterM.(2008).Mechanismsofsalinitytolerance.AnnualReviewofPlantBiology,59,651-681.OhDH,LeidiE,ZhangQ,HwangSM,LiY,QuinteroFJ,JiangX,DUrzoMP,LeeSY,ZhaoY,BahkJD,BressanRA,YunDJ,PardoJM,BohnertHJ.(2009).LossofhalophytismbyinterferencewithSOS1expression.PlantPhysiology,151(1),210-222.OliasR,EljakaouiZ,LiJ,DeMoralesPA,Marin-ManzanoMC,PardoJM,BelverA.(2009).TheplasmamembraneNa+/H+antiporterSOS1isessentialforsalttoleranceintomatoandaffectsthepartitioningofNa+betweenplantorgans.Plant,CellandEnvironment,32(7),904-916.PardoJM,CuberoB,LeidiEO,QuinteroFJ.(2006).Alkalicationexchangers:rolesincellularhomeostasisandstresstolerance.JournalofExperimentalBotany,57(5),1181-1199.QuinteroFJ,OhtaM,ShiH,ZhuJK,PardoJM.(2002).ReconstitutioninyeastoftheArabidopsisSOSsignalingpathwayforNa+homeostasis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,99(13),9061-9066.RajendranK,T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种SOS1s基因重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体为将SOS1s基因通过双酶切、连接入Gateway入门载体pENTRTM1A，然后经LR重组反应转入到酵母表达载体pAG426GPD，获得SOS1s基因重组表达载体pAG426GPD‑SOS1s；所述的SOS1s基因为如SEQ ID NO.1所示的AjSOS1基因、如SEQ ID NO.2所示的CrcSOS1基因、如SEQ ID NO.3所示的CcSOS1基因或如SEQ ID NO.4所示的CmSOS1基因。

【技术特征摘要】
1.一种SOS1s基因重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体为将SOS1s基因通过双
酶切、连接入Gateway入门载体pENTRTM1A，然后经LR重组反应转入到酵母表达载体
pAG426GPD，获得SOS1s基因重组表达载体pAG426GPD-SOS1s；所述的SOS1s基因为如SEQID
NO.1所示的AjSOS1基因、如SEQIDNO.2所示的CrcSOS1基因、如SEQIDNO.3所示的CcSOS1
基因或如SEQIDNO.4所示的CmSOS1基因。
2.根据权利要求1所述的SOS1s基因重组表达载体，其特征在于：采用以下步骤制备：
(1)菊花及其3种近缘种属植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1s基因的克隆
以芙蓉菊、牡蒿、大岛野路菊或栽培菊花‘神马’的植物根部为材料，提取RNA并反转录
成cDNA，根据序列信息设计特异引物：
上游引物F1：序列如SEQIDNO.5所示，
下游引物R1：序列如SEQIDNO.6所示；
上游引物F2：序列如SEQIDNO.7所示，
下游引物R2：序列如SEQIDNO.8所示；
以反转录的cDNA为模板，采用融合PCR的方法扩增，将以上游引物F1和下游引物R2高保
真扩增的PCR产物连接到pEASYTM-BluntZeroCloningVector，最终获得包含有SOS1s基因
的全长序列的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s；
(2)酵母表达载体pAG426GPD-SOS1s的构建
根据SOS1s基因的开放阅读框设计上下游引物，分别引入SalI和NotI酶切位点，上下
游引物分别为：
SOS1s-Sal-F：序列如SEQIDNO.9所示，
SOS1s-Not-R：序列如SEQIDNO.10所示；
以步骤(1)获得的阳性质粒pEASYTM-BluntZero-SOS1s为模板进行高保真PCR扩增引入
限制性酶切位点，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化特异性目的条带，将上述PCR凝
胶纯化产物由SalI和NotI双酶切得到的SOS1s基因片段与由SalI和NotI双酶切的
pENTRTM1A大片段连接、转化，提取阳性质粒pENTRTM1A-SOS1s，与酵母表达载体pAG426GPD质
粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒pAG426GPD-SOS1s。
3.包含有如权利要求1所述重组表达载体的转化细胞。
4.一种回补酵母突变体进行SOS1s基因功能验证的方法，其特征在于：该方法包括如下
步骤：
(1)酵母细胞的转化
分别将权利要求1或2所述的SOS1s基因重组表达载体pAG426GPD-SOS1s和空载体
pAG426GPD转化到酵母突变体菌株ANT3和G19感受态细胞中，涂布在相应缺陷的SD固体培养
基上；
(2)PCR检测
挑取阳性单克隆于包含相应缺陷的SD液体筛选培养基中培养，根据SOS1s基因ORF框序
列设计引物，引物序列为：
Mighty-F：序列如SEQIDNO.11所示，
Mighty-R：序列如SEQIDNO.12所示；
进行菌液PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
(3)酵母转化细胞Na+转运能力差异比较
将阳性酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋甲福，高姣姣，刘晨，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32