本发明专利技术提供转基因玉米事件IE034插入位点的外源插入片段的3'端旁侧序列及其应用。本发明专利技术还提供了用于检测该旁侧序列的引物、探针和试剂盒。本发明专利技术所提供的旁侧序列和引物适用于快速检测样品是否含有转基因玉米品系IE034，为转基因安全提供保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物
，具体设及一种转基因玉米IE034外源插入片段3' 端旁侦膊列及定性PCR检测方法，W及用于检测该序列的PCR引物、探针和试剂盒。
技术介绍
玉米作为我国Ξ大粮食作物之一，播种面积和总产量均居第二位，在我国粮食安 全中发挥着重要的作用。近年来，国内玉米种植面积保持在5亿亩W上，同时，每年还要进口 300万-500万吨的转基因玉米弥补消费缺口。而随着饲用玉米需求的刚性增长和近年来玉 米深加工业的快速发展，国内玉米消费还将持续增长。但是病虫害、杂草、干旱、盐碱等生物 或非生物胁迫严重影响了玉米生产。培育具有抗虫、抗除草剂、抗病等性状的转基因玉米品 种并应用到实际生产中，能够减少玉米产量损失，减少农药化肥使用量。其中化蛋白的发现 掲开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。化杀虫蛋白基因来源于苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis即化杆菌），是天然存在于±壤中的格兰氏阳性菌，在其芽抱形成过程中产 生许多W结晶方式存在的蛋白质，运些蛋白质具有杀虫活性，通常也被称为化杀虫蛋白。Bt 杀虫蛋白按氨基酸序列的同源性可分为45大类313种，Crylle抗虫基因属于BT杀虫蛋白家 族，是中国农业科学院植物保护研究所首次分离克隆出来的一种新的化y基因，随后中国农 业科学院作物科学研究所将Crylle基因通过农杆菌介导法转入到了中国玉米优良自交系 综31基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米事件IE034,现已在进行环境释放阶段的安全评 价，对于未来国内日益高涨的玉米需求，该抗虫玉米有可能进入商业化种植并推广。 转基因玉米IE034已申请"农业转基因生物安全评价证书"，因而其分子特征，包括 插入序列、插入位点及其相应的检测方法都需要非常清晰，其中中国专利201210065919.X 提供了转基因玉米事件IE034插入位点的外源5'端旁侧DNA序列，该序列全长3^bp。但目前 尚不清楚转基因玉米事件IE034插入位点的外源3'端旁侧DNA序列，关键原因是3'端旁侧序 列结构更为复杂，受体基因组序列和载体序列间或出现，需要更精准的实验进行鉴定。因此 3'端旁侧DNA序列及鉴定方法是转基因玉米IE034安全管理不可或缺的部分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供转基因玉米事件IE034插入位点的外源插入片段的3'端旁侧 DNA序列及其应用，W及用于检测该序列的PCR引物、探针和试剂盒。 为达到W上目的，本专利技术提供了转基因玉米IE034外源插入片段3'端旁侧DNA序 列，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者为SEQ ID NO. 1所示序列的特异性片段。 本专利技术还提供了所述DNA序列在检测转基因玉米中的应用。 本专利技术还提供了用于检测权利要求1所述的DNA的特异性PCR检测引物及探针，所 述引物的核巧酸序列为：[000引 上游引物：5 ' -CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '，下游引物：5 ' -TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3 ' ； 探针为：5 ' -F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3 '。 可选的，在所述探针中，F为FAM、胎义、了61、如6、￥1。^116、〔73或切5;9为了日111拘、 Rox、Dabcy、Miq1或 Miq2。 本专利技术还提供了一种转基因玉米IE034的检测试剂盒，所述试剂盒含有特异性PCR 检测引物及探针，所述引物的核巧酸序列为： 上游引物：5 '-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '， 下游引物：5'-了4了661'(：1'1'(：176(：1'1^6了6(：1'1'1'1'-3'； 探针为：5 ' -F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3 '。 可选的，在所述探针中，F为FAM、胎义、了61、如6、￥1。^116、〔73或切5;9为了日111拘、 Rox、Dabcy、Miq1或 Miq2。 本专利技术还提供了一种转基因玉米事件IE034的检测方法，所述方法包括：W样品总 DNA为模板利用本专利技术所提供的引物及探针进行实时巧光PCR扩增反应，检测扩增反应产物 中是否具有SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。 可选的，所述实时巧光PCR扩增的反应程序为:95°C10min;95°C15sec，60°C60sec 40个循环。可选的，实时巧光PCR扩增的反应体系为： 2-GoldStar TaqMan Mixture 1 ΟμL 上游引物UOuM) 0.4μ1下游引物（lOuM) 0 4μΙ 探针 OOuM) 0.4μ1 DNA模扳 2μΙ加入灭菌蒸馈水至总体系为20μ1。 本专利技术还提供了上述引物及探针在检测转基因玉米中的应用。 本专利技术还提供了上述试剂盒在检测转基因玉米中的应用。 本专利技术通过ΤΑ化-PCR扩增得到了抗虫转基因玉米事件ΙΕ034的3'旁侧序列，并根 据该序列设计获得特异性引物和探针，用于检测转基因玉米ΙΕ034。利用该方法，在实时巧 光PCR结束后即能判断所检测样品中是否含有转基因玉米ΙΕ034。本专利技术所提供的旁侧序列 和引物适用于对转基因玉米ΙΕ034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品（包括植株、组织、种 子及其制品）的检测。【附图说明】 图1为实施例1中Ξ轮反应的PCR产物电泳图：其中，图1Α为第一轮PCR扩增产物，图1Β为第二轮PCR扩增产物，图1C为第Ξ轮PCR 扩增产物； 图2为转基因玉米ΙΕ034实时巧光PCR检测结果； 图3为灵敏度检测扩增曲线。【具体实施方式】 W下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecy lar cloning:a laboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 实施例1 本实施例用于说明转基因玉米IE034的外源插入片段3'端侧翼序列的获得。 1.提取玉米种子基因组DNA。 1.1样品处理： 取适量玉米种子（由中国农业科学院作物所王国英研究员提供转基因玉米 "IE034" W及对照玉米"综3Γ )在液氮速冻下经莱驰MM400冷冻研磨仪磨成粉末状 1.2玉米种子DNA提取： 采用天根DP305-02植物基因组DNA提取试剂盒提取玉米种子基因组DNA，操作按产 品说明书进行。 1.3 DNA检测： 取扣1提取的DNA溶液，W1 %的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提 取DNA的质量。最终采用ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定所提取的DNA的浓度和纯度。 2.通过TAIL-PCR方法获得转基因玉米外源基因整合位点3 '端侧翼序列。 2.1引物设计：根据中国农业科学院作物所王国英研究员提供目的基因表达载体p3301UbiIe及 元件的结构，采用TAlX-PCR(the;rmal asymmetric interlaced PCR)技术，获得转基因玉米 外源基因整合位点3'端侧翼序列并设计如下表1所示的引物序列： 表1每轮TAIkPCR扩增的引物序列 2.2 TAIkPCRPCR扩增： 本文档来自技高网...
【技术保护点】
转基因玉米IE034外源插入片段3'端旁侧DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜智欣，付伟，魏霜，乾义柯，王晨光，朱鹏宇，王国英，朱水芳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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