包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体制造技术

提供了包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。所述核酸构建体允许以高生产力廉价地制备啶南平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体对相关申请的交叉参考本专利申请要求在2010年1月26日提交的日本专利申请号14700/2010和在2010年11月11日提交的日本专利申请号253183/2010的优先权，并且将其全部完整公开并入本文作为参考。专利技术背景
本专利技术涉及包含啶南平(pyripyropene)生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。
技术介绍
目前已经证明在啶南平中有从啶南平A至啶南平R的18种类型的天然存在的类似物，所述类似物在它们侧链的结构中不同(非专利文献1)。已经公开啶南平具有ACAT抑制活性(专利文献1)。由此期望其用于治疗胆固醇积累等引起的疾病。并且，已经公开啶南平具有针对棉铃虫(Helicoverlpaarmlgera)幼虫(非专利文献2)，小菜蛾(Dlamondbackmoth)幼虫(专利文献2)，黄粉虫(专利文献2)或者蚜虫(aphids)(专利文献3)的杀虫活性，并且由此期望其用作杀虫剂。已知啶南平是丝状真菌作为次级代谢物产生的。例如，已经公开了粪生青霉(Penicilliumcoprobium)PF1169菌株(专利文献4),烟曲霉(Aspergillusfumigatus)IFO-1289菌株(专利文献5)，网状孢正青霉(Eupenicilliumreticulosporum)NRRL-3446菌株(非专利文献2)或者灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)F1959菌株(专利文献2)每种产生啶南平。通过培养上文提到的生产细菌并且收集啶南平进行啶南平的工业生产。通常，分离的天然存在的微生物产生的次级代谢产物的量是很少的。为了在工业上使用该产物，需要提高这些期望产物的生产力。为了提高这些期望产物的生产力，已经进行了用于培养生产期望产物的微生物的方法的研究，培养基组分和发酵条件的改变如加入前体的研究，以及通过用紫外线放射或者诱变剂突变对细菌菌株的修饰。此外，除了这些方法，最近已经进行了使用基因重组提高生产力的方法。通过基因重组提高生产力的一般方法是提高生物合成基因的表达。例如，通过这种方法，公开了提高无孢目(agonomycetales)产生的PF1022物质的生产力的方法(专利文献6)。为了应用这种方法，需要分离期望产物的生物合成基因并且需要建立在期望的产物产生微生物中用于转化的方法。对于啶南平，目前没有关于分离它们的生物合成基因簇的报告。另外，还未建立将产生啶南平的真菌作为宿主的转化方法。因此，目前很难将啶南平的生物合成基因簇引入到产生啶南平的微生物中，并且通过基因重组提高生产力是不能实现的。现有技术参考文献专利文献专利文献1日本特开公报号184158/1994专利文献2WO2004/060065专利文献3WO2006/129714专利文献4技术公开杂志号500997/2008专利文献5日本特开公报号360895/1992专利文献6日本专利号3961289非专利文献非专利文献1JournalofAntibiotics(1996),49(3),292-298非专利文献2AppliedandEnvironmentalMicrobiology(1995),61(12),4429-4435专利技术概述本专利技术人已经发现，通过在宿主中表达包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体，显著地提高了啶南平的生产力。基于这种发现已经做出了本专利技术。相应地，本专利技术的目的是提供包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。根据本专利技术的一个实施方案，提供了包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。根据本专利技术的另一个实施方案，也提供了转化体，其通过将上文提到的核酸构建体引入到宿主中获得。进一步地，根据本专利技术的另一个实施方案，提供了转化体，其通过将包含上文提到的啶南平生物合成基因簇的核酸构建体和包含上文提到的标记基因的核酸构建体同时或者单独引入到宿主中获得。此外，根据本专利技术的另一个实施方案，提供生产啶南平的方法，所述方法包括培养上文提到的转化体并且从培养物中收集啶南平。附图简述[图1]图1显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp梯)，泳道1：SEQIDNO：1和2的引物，泳道2：SEQIDNO：239和240的引物，泳道3：SEQIDNO：237和238的引物，泳道4：SEQIDNO：241和242的引物，泳道5：SEQIDNO：247和248的引物，泳道6：SEQIDNO：251和252的引物，泳道7：SEQIDNO：245和246的引物，泳道8：SEQIDNO：243和244的引物，泳道9：SEQIDNO：249和250的引物，泳道10：SEQIDNO：235和236的引物，泳道11：SEQIDNO：233和234的引物，泳道12：SEQIDNO：227和228的引物，泳道13：SEQIDNO：229和230的引物，泳道14：SEQIDNO：231和232的引物。[图2]类似于图1，图2显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp梯)，泳道1：SEQIDNO：253和254的引物，泳道2：SEQIDNO：257和258的引物，泳道3：SEQIDNO：259和260的引物，泳道4：SEQIDNO：255和256的引物，泳道5：SEQIDNO：261和262的引物。[图3]类似于图1，图3显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：泳道1：分子量标记物(100bp梯)，泳道2：SEQIDNO：264和265的引物(400bp扩增片段)。[图4]图4显示用于使用的丝状真菌的质粒载体pBI-AnGpD-EGFP的图谱。在该图中，RB指右边界，HYGr指的是潮霉素抗性编码区，PAngpdA指的是构巢曲霉(Aspergillusnidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，EGFP指的是增强的绿色荧光蛋白编码区，TAngpdA指的是构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子，并且LB指的是左边界。[图5A]在图5A中，左图显示用土壤杆菌(Agrobacterium)感染形成的潮霉素抗性菌落，并且右图显示GFP荧光观察的结果。[图5B]在图5B中,左图显示不用土壤杆菌感染的粪生青霉菌株PF1169的菌落，在不含潮霉素的培养基中形成菌落，并且右图显示GFP荧光观察的结果。专利技术详述微生物的保藏用质粒pCC1-PP1转化的大肠杆菌(Escherichiacoli)(大肠杆菌EPI300TM-T1R)于2008年10月9日(原始保藏日)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERMBP-11133(从国内保藏FERMP-21704移管)(保藏者所用的识别标识：大肠杆菌EPI300TM-T1R/pCC1-PP1)。在2009年12月14日将用质粒pPYRI02转化的大肠杆菌，以保藏号FERMBP-11203(保藏者所用的识别标识：XL1-BlueMRA/pPYRI02)保藏在独立行政法人产业技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.26 JP 014700/2010;2010.11.11 JP 253183/2011.核酸构建体，其包含啶南平生物合成基因簇和标记基因，其中所述啶南平生物合成基因簇由SEQIDNO：266中的从2911至27797的核苷酸序列组成。2.核酸构建体，其包含啶南平生物合成基因簇和标记基因，其中所述啶南平生物合成基因簇由SEQIDNO：266中的从1至25000或从2446至27505的核苷酸序列组成。3.根据权利要求1或2的核酸构建体，其中所述标记基因是药物抗性基因或者营养缺陷基因。4.根据权利要求1或2的核酸构建体，其中所述标记基因是越霉素抗性基因或者潮霉素抗性基因。5.转化体，其能通过将核酸构建体引入到宿主中而得到，所述核酸构建体包含啶南平生物合成基因簇和标记基因，其中所述啶南平生物合成基因簇由目的基因和表达调节区组成，其中所述目的基因由选自下面(a)至(i)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列组成：(a)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列，(b)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列，(c)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，(d)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，(e)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列，(f)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列，(g)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列，(h)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，以及(i)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列，其中所述表达调节区由选自下面(j)到(s)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列组成：(j)在SEQIDNO：266中显示的核苷酸序列的从2911至3341的核苷酸序列，(k)在SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：相原智，隅田奈绪美，村岛弘一郎，矢内耕二，安西弘行，山本憲太朗，
申请(专利权)人：明治制果药业株式会社，
类型：
国别省市：