本发明专利技术涉及一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗的佐剂及制备方法，这种佐剂中有重组猪白介素2（PorcineInterleukine-2，pIL-2）。本发明专利技术的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂是由猪白介素2被一种脂质基质和乳化剂包裹构成的粒径为50-1000nm的纳米颗粒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗用佐剂，特别是一种兽用疫苗的佐剂。确切讲本专利技术涉及一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗的佐剂及制备方法，这种佐剂中有重组猪白介素2(Porcine Interleukine-2, pIL_2)。
技术介绍
佐剂是一种先与抗原或与抗原混合后同时注入到人或动物体内，能够增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的物质。佐剂是疫苗的主要组成成分，在疫苗的质量提高和改进中扮演着重要的作用。白介素2 (Interleukine-2, IL-2)是一种多种功能的细胞因子,能够通过自分泌或旁分泌形式作用于一些细胞的表面，从而启动机体内细胞的信号通路，发挥免疫调节作用。IL-2是由T细胞产生的多功能的活性糖蛋白，能够促进T、B淋巴细胞的增殖；增强细胞毒T细胞的杀伤活性；促进免疫球蛋白的产生；刺激许多免疫细胞产生多种细胞因子；能 够增强机体的细胞和体液免疫应答。近年来研究表明，IL-2可提高机体对疫苗的免疫应答和控制疾病的发生。可应用于多种疫苗中作为免疫增强剂，如猪口蹄疫疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗、疱疹病毒疫苗等。国外学者报道了单次或多次注射重组牛IL-2对BHV-I副流感病毒二联苗及牛病毒腹泻病毒苗的作用，结果表明单次或多次注射均可增强两种疫苗的免疫效果，但是多次注射效果会更好。这些研究表明重组IL-2作为疫苗分子佐剂，不仅能够高效特异地调节机体对疫苗的反应，而且可调节体液和细胞免疫应答(lofthouse S A, etal, 1996)。然而重组蛋白用于疫苗佐剂也存在以下的缺点半衰期较短，易受内外环境的影响而活性降低，需要多次注射；另外，一次性大剂量的使用还可导致发热、炎症等副作用，这都给细胞因子重组蛋白在临床实践应用中带来不便。
技术实现思路
本专利技术提供一种含有重组猪白介素2的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂，本佐剂克服现有重组PIL-2作为疫苗佐剂的不足，而且具有安全、高效、廉价的优点；同时提供一种这种佐剂的制备方法。本专利技术的一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂，这种佐剂是由猪白介素2被一种脂质基质和乳化剂包裹构成的粒径为50-1000nm的纳米颗粒。本专利技术的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂所用的脂质基质为氢化蓖麻油，所用的乳化剂为聚乙丙交脂和聚乙烯醇，所用的猪白介素2为酵母表达系统表达的重组蛋白。本专利技术的猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂是由10重量份的氢化蓖麻油和2重量份的聚乙丙交脂包裹O. 5-1重量份的重组pIL-2。本专利技术的佐剂可用于亚洲I型口蹄疫病毒灭活抗原混合物构成的亚洲亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗。本专利技术的佐剂的制备方法采用了复乳溶剂挥发法制备。一种具体的制备方法是将IOOmg的氢化蓖麻油和20mg的聚乙丙交脂溶于ImL的三氯甲烷中作为有机相，将该有机相加热到30-40°C;纯化后的重组pIL-2溶于pH=8的磷酸缓冲液中，使终浓度为20mg_50mg/ml ;取200μ 的前述液体为水相，然后在充分搅拌条件下把水相缓慢加入到前述的有机相中，冰浴中超声形成(w/o)相的乳液，将制备好的该乳液加入到5mL的1%的聚乙烯醇水溶液中，进一步的利用乳化仪乳化形成(w/o/w)相的乳液，再在室温下充分搅拌，使有机溶剂完全挥发，固化得到聚合物纳米粒分散体系，加入5-10倍体积的灭菌水收集纳米粒，并用3 5mL的蒸馏水重悬，冷冻干燥获得所要的佐剂。本专利技术实际上是一种固体脂质纳米粒(Solid Lipid Nanoparticle, SLN)。SLN是一类以固态天然或半合成类酯(如卵磷脂)、脂肪酸(如硬脂酸)或甘油三脂等广义脂质为载体原料，利用不同方法制成粒径为50-1000nm的固态胶粒给药体系。与脂质体和微乳相比目前的产物由于被包封于SLN的固体骨架中而实现了更好的控释和缓释效果；其最突出的优点在于它具有固态基质，这样可以保护化学性质不稳定的物质不被分解破坏，并可以调 节药物的释放。由于在制备过程中蕴含了大规模生产的基础，使SLN更具有吸引力。本专利技术与现有技术相比，具有明显的特点和优势首先，按本专利技术制造的SLN-pIL-2新型纳米佐剂是一种粒径在300-500nm的类球形粒子，其中既含有重组pIL_2，也含有脂质材料及聚合物聚乙丙交脂，这些材料也可发挥一定佐剂效应。其次，该纳米佐剂的重组PIL-2被包裹在脂质核内从而保护其免受外界环境的影响而降解。此外，脂质材料和聚合物聚乙丙交脂可在体内生物降解，而使包裹的重组pIL-2持续的缓慢释放，起到微量长期作用于机体免疫相关细胞，从而提高其免疫佐剂效应，同时也避免了大量一次性释放所引起的毒副作用。最后，制备这种纳米佐剂过程简单易行，而且所用的材料价格低廉,因此成本也较低。对于新型的SLN-pIL-2纳米佐剂，可以缓慢释放被包裹的pIL_2，且具有较低毒副作用，且免疫佐剂效应明显的提高具体表现在(I)用制备的SLN-pIL-2加入到BHK细胞中，当浓度达到7. 5mg/mL时作用24h时后，其细胞生长状态良好；(2)在体外可以持续释放12d以上；(3)与猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活抗原配伍制备疫苗，免疫小鼠后，与未包裹的重组pIL-2相比较，既可提高特异性抗体的水平，也可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖以及干扰素的分泌，包裹后的PIL-2可达到完全弗氏佐剂的效果。本专利技术中将重组pIL-2包裹于SLN中(即SLN_IL_2)，以脂质纳米粒作为载体以便保护重组蛋白在体内不被快速降解，提高了重组PIL-2的免疫佐剂效果，延缓其释放，从而提高其免疫佐剂效果，同时本专利技术的佐剂还具有毒性低的优点。附图说明图I、利用透射电镜观测纳米粒的粒径大小。图2、在BHK细胞中检测SLN-pIL-2和SLN的毒性实验曲线。图3、包裹pIL-2的粒子在体外释放pIL-2的检测曲线。图4、免疫脾淋巴细胞IFN- Y的分泌水平图。图5、免疫脾淋巴细胞中IL-4的分泌水平图。图6、流式细胞仪检测脾淋巴细胞增殖反应能力图。具体实施例方式本专利技术的实例分成2个部分完成，实例一含有重组猪白介素2固体脂质纳米粒的制备特征表征；实例二 制备的纳米粒作为亚洲I型口蹄疫病毒灭活抗原的佐剂构成的疫苗免疫效果试验。实例一重组猪白介素2固体脂质纳米粒的制备特征表征 I.I固体脂质纳米粒的制备及特征与表征 通过采用复乳溶剂挥发法制备过程如下称取IOOmg氢化蓖麻油和20mg的PLGA溶于ImL的三氯甲烷中作为有机相，并将该有机相加热到30-40°C ;将纯化的IL-2蛋白溶解在PBS中(pH=8)，取200μ 的作为水相；然后把水相缓慢加入到有机相中，边加边用磁力搅拌器搅拌，在冰浴中超声50s (300w)及形成(w/o)形式的乳液；将制备好的该乳液加入到5mL的1%的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，进一步的利用乳化仪乳(rpm3000, lmin)乳化化形成(w/o/w)相的乳液，并在显微镜下观察乳化为均匀分布的液滴；再在室温下利用磁力搅拌器充分搅拌6-8h，使有机溶剂完全挥发，固化得到聚合物纳米粒分散体系；加入30 50mL灭菌 水(12000rpm,离心lh，4°C )收集纳米粒，并用3 5mL的蒸馏水重悬，然后利用冷冻干燥仪冻干。空的SLN微球利用200μ 的PBS代替含有重组pIL_2的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪用亚洲I型口蹄疫病毒灭活疫苗佐剂，这种佐剂中有重组猪白介素2，其特征在于这种佐剂是由重组猪白介素2被一种脂质基质和乳化剂包裹构成的粒径为300？500nm的脂质纳米颗粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：景志忠，陈国华，曾爽，房永祥，贾怀杰，何小兵，蔺国珍，才学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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