用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用，该分子标记位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上，它的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。利用本发明专利技术提供的特异性分子标记可实现对疣粒野生稻的快速、准确检测，为口岸快速鉴定珍稀物种提供了可靠的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用。
技术介绍
野生稻在植物分类学上隶属于单子叶植物纲、禾本目、禾本科，野生稻为禾本科稻属野生种的泛称，1973年，被誉为“杂交稻之父”的中国著名水稻专家袁隆平利用在海南发现的一株野生稻，成功培育出杂交水稻，掀起了水稻生产的“第二次緑色革命”。中国野生稻资源是中国稻种资源的重要组成部分，作为栽培稻的野生亲缘种，具有栽培稻中缺少或已消失的优异基因，如抗寒性、抗病虫性、抗逆、雄性不育种质、恢复种质等构成了水稻遗传改良的重要基因源。然而近年来，随着经济的发展，人类活动严重干扰和破坏了野生稻、的生存环境，加上物种流失的加剧，使野生稻处于严重的濒危状态和灭绝的边缘，所以保护和鉴定野生稻尤为重要。在20多个野生稻种中，我国只分布有三种野生稻即普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.),药用野生稻(Oryza officinalis Wall, ex Watt.)和抚粒野生稻(Oryza granulata Nees et Am. ex Watt.)。其中抚粒野生稻被定为国家ニ级保护植物，列入中国植物红皮书。鉴于目前还没有关于疣粒野生稻鉴定技术方面的报道，因此建立疣粒野生稻的查验技术方法以便于ロ岸查验应用，以及对于防止我国重要物种资源流失等方面具有十分重要的意义。近年来，以DNA为基础的分子标记技术如RFLP、RAPD, SSR、AFLP等在稻属植物的系统关系研究中被广泛应用，但是对于确立稻属植物种间系统关系，DNA标记所提供的信息位点有限。植物细胞中存在3套基因组核基因组(nDNA)、叶绿体基因组(cpDNA)和线粒体基因组(mtDNA)，因其结构和功能上的差异，进化速率也有所不同，在植物系统发育重建中，来自叶绿体基因组的DNA片段和来自核基因编码核糖体的DNA片段是两个最主要的分子证据来源，线粒体基因组的进化速率慢且在植物不同种间的基因组结构和基因排序变异非常大，在系统发育研究中应用有限。单拷贝核基因(single-copy nuclear gene)是指基因组中拷贝数目少，只有I个或几个拷贝的核基因，多数是生物体内组成型表达的持家基因，具有中等程度的进化速率和适合系统发育分析的基因结构，在许多植物类群的研究中，单拷贝核基因相比含有更多的信息位点，具有更大的潜力来重建系统发育。磷酸丙糖异构酶(Triose phosphateisomerase, TPI)是糖酵解过程中催化ニ羟丙酮磷酸与3_磷酸甘油醛之间可逆反应的ー种异构酶，其催化功能高度保守，其基因分子结构在生物的长期进化中未发生大的改变，可作为生物遗传分化和分子进化研究中的重要指标。近年来，有研究发现水稻胞质TPI是单拷贝基因，且为直系同源基因(orthologs,也称直向同源和垂直同源),该基因的进化史可以反映物种的进化
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记及其应用。本专利技术通过对稻属(Oryza L.)及其近缘属等18个禾本科植物单拷贝核基因TPI序列进行扩增和测序， 分析其系统进化关系及序列差异，得到用于鉴定疣粒野生稻(O. granulata)的特异性分子标记。序列分析表明，栽培稻间TPI基因序列碱基变异少,野生稻相对变异丰富，其中疣粒野生稻变异尤为明显，根据疣粒野生稻的TPI基因序列特异位点设计引物，利用该特异性分子标记可实现对疣粒野生稻的准确鉴定。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记，其位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本专利技术还提供用于鉴定疣粒野生稻的特异性PCR引物，包括正向引物F5' -CAGTGGTGGAGCCAGAAATT-3，和反向引物 R5’ -GCTTAATCAGGGGCAGAGGC-3’。本专利技术还提供所述特异性分子标记在鉴定疣粒野生稻中的应用，其包括步骤1)提取待测植株的基因组DNA ;2)以待测植株的基因组DNA为模版，利用权利要求2所述引物F和R，进行PCR扩增反应；3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的产物，则待测植株为疣粒野生稻。其中，PCR反应体系以25 μ I计为30ng/μ I模板DNA I μ 1，IOpmol/μ I引物F和R 各 I μ 1,2. 5mmol/L dNTP mix2. O μ l,5U/y L Taq DNA 聚合酶 O. 3 μ I，10XPCR 反应缓冲液 2. 5 μ l,25mmol/L MgCl22 μ I，余量为水。PCR 反应条件为94°C 5 分钟；94°C 30 秒，60°C 30 秒，72°C 30 秒，24 个循环；72 °C 10 分钟。本专利技术还提供含有引物F和R的用于检测疣粒野生稻的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的ー种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。本专利技术进一歩提供用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记在植物分子标记辅助育种中的应用。本专利技术通过对稻属(Oryza L.)及其近缘属等18个禾本科植物单拷贝核基因TPI序列的比较分析，根据不同属间具有较丰富的碱基差异，并基于序列差异位点的分析，开发出物种特异的分子标记进行物种鉴定，为ロ岸快速鉴定珍稀物种提供了可靠的检测方法。利用本专利技术提供的特异性分子标记可实现对疣粒野生稻的快速、准确检測。附图说明图I为水稻材料TPI基因扩增结果；其中，M DNA marker DL500 ；1 :宽叶野生稻；2:高杆野生稻；3 :斑点野生稻；4 :紧穗野生稻；5 :药用野生稻；6 :疣粒野生稻；7 :根茎野生稻；8 :普通野生稻；9 :桂林野生稻；10 :东乡野生稻；11 :普野临高；12 :普野东方；13 :普野乐东；14 :普野琼海；15 :日本睛；16 :湘矮早7 ；17 :新香优80 ；18 :水对照。图2为TPI基因系统发生树；其中，缩写字母代表的水稻材料名称见表I。图3为稻属及其近缘属植物TPI基因序列比对结果；其中，縮写字母代表的水稻材料名称见表I 表示缺失碱基；“ · ”表示相同碱基；方框部分为疣粒野生稻特异碱基位点。图4为ptYL211片段PCR扩增结果；其中，M DNA marker DL500 ；1 :宽叶野生稻；2 :高杆野生稻；3 :斑点野生稻；4 :紧穗野生稻；5 :药用野生稻；6 :疣粒野生稻；7 :根茎野生稻；8 :普通野生稻；9 :桂林野生稻；10 :东乡野生稻；11 :普野临高；12 :普野东方；13 :普野乐东；14 :普野琼海；15 :日本睛；16 :湘矮早7 ；17 :新香优80 ；18 :水对照。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册'(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。实施例I用于鉴定疣粒野生稻的特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记，其特征在于，其位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上，它的核苷酸序列如SEQ？IDNO.1所示。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定疣粒野生稻的特异性分子标记，其特征在于，其位于禾本科植物单拷贝核基因TPI序列上,它的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。2.用于鉴定疣粒野生稻的特异性PCR引物，其特征在于，包括正向引物F5' -CAGTGGTGGAGCCAGAAATT-3’ 和反向引物 R5’ -GCTTAATCAGGGGCAGAGGC-3’。3.权利要求I所述的特异性分子标记在鉴定疣粒野生稻中的应用，其包括步骤 1)提取待测植株的基因组DNA； 2)以待测植株的基因组DNA为模版，利用权利要求2所述引物F和R，进行PCR扩增反应； 3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出如SEQID NO. I所示核苷酸序列的产物，则待测植株为疣粒野生稻。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在干，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以 25 ii I 计为30ng/ii I 模板 DNA I U 1，IOp...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋云，陈岩，徐晗，李明福，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：