本发明专利技术涉及一种新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用，属结核病医学免疫学诊断技术领域。本发明专利技术的融合蛋白由Rv0057和Rv1352两种蛋白的抗原表位依次连接构成，Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列1所示；Rv1352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。与目前商品化的抗体检测试剂盒相比，本发明专利技术所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在结核病血清学诊断方面均具有敏度高、特异性强、并与其它抗原具有互补性的优点，可用于检测血清、胸水等体液标本中特异的抗结核抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用，具体涉及应用基因工程技术制备的一种新型结核分枝杆菌特异性的多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352及其制备方法，属于结核病医学免疫学检测
技术介绍
在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回 升趋势，尤其是结核菌耐药问题、与人免疫缺陷病毒(HIV)合并感染使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800 1000万，每年死亡人数约200万。中国的结核病疫情相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查初步结果表明，15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万，其中传染性肺结核患病率为66/10万。结核病死亡在传染病中居第一位。结核病也是AIDS感染者死亡的主要原因，根据1996年WHO统计每3个死亡的AIDS患者中就有一例死于合并结核，45-85%HIV死亡者是由于结核病诊断延误所致。早期诊断、发现病人、选择敏感的抗结核药物进行有效治疗是控制结核病的关键。虽然结核病细菌学检查是目前发现传染源的主要途径和手段，是结核病诊断的“金标准”，但临床标本涂片、镜检的灵敏度低，需IO4 — IO5个菌/ml痰才能检出，阳性率只有20-30% ；传统的分枝杆菌培养阳性率低(只有30%左右)，需4-8周时间。显然目前临床上常规应用的诊断方法不能满足结核病早期诊断、鉴别诊断的需要。因此，结核病的快速诊断、鉴别诊断是目前亟待解决的重要课题之一。尤其是菌阴肺结核、肺外结核和儿童结核的诊断十分困难，而免疫学检查标本来源方便、简便、快速、灵敏、特异，成为结核病重要的辅助检查手段。结核病患者大都处于免疫紊乱状态，机体未能诱导有效的免疫应答而导致发病。在疾病的早、中期，机体的免疫功能亢进，Thl型免疫应答逐渐减弱，Th2型免疫应答增强，使Thl型免疫向Th2型免疫转移，表现为Thl型细胞因子和血清抗体逐渐增高，皮肤变态反应增强。而在疾病的中后期，细胞免疫功能低下，机体产生各种抗病因子的功能下降，体液免疫功能增强，结核病病情恶化，表现为血清抗体增高。因此，抗结核抗体检测成为临床上应用较广泛的一种简便、快速、价廉的结核病辅助诊断手段，尤其是对于那些诊断困难的菌阴肺结核、儿童结核病或肺外结核病具有实用价值。但目前尚不完全清楚结核分枝杆菌哪些抗原主要引起细胞免疫反应，而哪些抗原主要引起体液免疫反应；结核潜伏感染者、结核病患者对结核菌的不同抗原是如何反应的。目前已发现不同结核病患者对不同结核分枝杆菌抗原产生不同水平的抗体，而同一个患者在疾病的不同阶段对不同抗原的免疫反应也不同，使得每一位患者血清识别抗原的种类、数目和水平都有很大的差异，抗原识别的个体差异是人类结核病体液免疫的主要特性。此外，其他细菌感染也可能产生假阳性反应，导致目前商业化的结核抗体检测试剂盒存在灵敏度和特异性不高的问题，目前任何一种单一的抗原进行结核病血清学诊断时的灵敏度均未超过70%，尚无确切的抗原或成套的抗原可被所有的或大多数的患者所识别。抗原的筛选、评价对抗结核抗体的检测至关重要，筛选灵敏度高、特异性强、具有互补性的抗原构建融合蛋白，不仅可提高检测的灵敏度和特异性，还可降低成本，从而弥补目前诊断方法的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服已有技术的不足，提供一种新型结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352及其制备方法，作为结核病抗体检测抗原，可提高结核抗体检测的灵敏度和特异性，应用于结核病的快速诊断。一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其由Rv0057和Rvl352两种蛋白抗原的关键 表位依次连接构成，称为Rv0057-Rvl352 ;Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列(DNA序列)如序列表中序列I所示；Rvl352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。所述的Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。Rv0577抗原是一种功能未知的醛酮变位酶，仅在结核分枝杆菌复合群中分泌表达，而环境中的分枝杆菌不存在。该蛋白可在结核病患者的肺部表达，存在于多数活动性结核患者的痰液中，并可刺激机体产生体液免疫反应，是已知的可与结核患者血清反应的抗原之一 ORv0057抗原是结核分枝杆菌一个功能未知的蛋白，而Rvl352抗原是结核分枝杆菌复合群保守的一个外膜蛋白，与Rvl351在一个操纵子。它们均可刺激T细胞反应产生IFN-Y，虽然目前国内外尚未见该蛋白在结核病血清学诊断方面的研究报道，但本专利技术人发现这两种抗原的融合蛋白具有很好的抗原性，可与血清中抗结核抗体反应，具有较高的灵敏度和特异性(分别为66. 7%和91. 8%)。将上述RV0057和Rvl352两种结核分枝杆菌蛋白关键的抗原表位依次连接，并删除无抗原表位区域，从而提高结核抗体检测的灵敏度和特异性，实现结核病患者的早期发现。本专利技术提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352，是选择结核分枝杆菌两种蛋白Rv0057和Rvl352关键的抗原表位，并将其依次连接，通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化。本专利技术提出上述融合蛋白Rv0057-Rvl352的制备(构建)方法，包括如下步骤(I)两个蛋白抗原表位融合的设计分析结核分枝杆菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位连接、形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。(2)两个蛋白融合的克隆通过基因工程技术进行克隆。①在Rv0057上游引物添加Nhe I酶切位点，在Rv0057下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I, Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5a受体菌中。经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0057/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。②在Rvl352上游引物添加Nhe I酶切位点和编码I个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rvl352下游引物添加Spe I、Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5 α受体菌中。经过质粒提取，经Τ7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rvl352/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。③用Spe I和Xho I双酶切Rv0057/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和XhoI双酶切Rvl352/pET30aSETB质粒，获得的Rvl352片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21 (本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其由RV0057和RV1352两种蛋白的抗原表位依次连接构成，Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列I所示；Rvl352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。2.根据权利要求I所述的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其特征在于所述的Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。3.权利要求I或2所述的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白的制备方法，包括如下步骤 (O分析结核分枝杆菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位连接，形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端; (2)两个蛋白融合的克隆 ①在Rv0057上游弓I物添加NheI酶切位点，在Rv0057下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和Xho I双酶切后，插入用Nhe I和Xho I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5a受体菌中；经过质...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪琼，阳幼荣，梁艳，赵卫国，冯金栋，张俊仙，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇九医院，
类型：发明
国别省市：
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