基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用技术

本发明专利技术具体涉及一种基于AAV(Adeno-associated?virus)载体的高通量miRNA活性检测方法miRNA?Asensor?Array(miRNA?sensor?based?AAV?vector?Array，基于AAV载体的、用于miRNA活性检测的生物传感器)及其在细胞miRNA活性谱检测、不同细胞特征miRNA活性谱检测和外界因素(如药物、转基因)对细胞miRNA活性谱的影响等方面的应用。miRNA?Asensor?Array由不携带miRNA靶序列的control?Asensor和多种携带miRNA靶序列的miRNA?Asensor按照一定顺序排列组成。Control?Asensor和miRNA?Asensor均包含Gluc(Gaussia?luciferase)和Fluc(firefly?luciferase)两个独立的表达单元，其中Gluc用于miRNA活性检测，Fluc用于计算miRNA?Asensor的转导系数，校正不同miRNA?Asensor之间的感染性差异。使用时，将待检测细胞加入到制备好的miRNA?Asensor?Array中，一段时间后检测Gluc表达情况并根据转导系数计算出细胞中miRNA活性谱。该方法为细胞miRNA活性谱的制作及其影响因素研究提供了新的选择。

High throughput miRNA activity detection method based on AAV vector and its application

The present invention relates to a method based on AAV (Adeno-associated? Virus) miRNA detection method for high throughput miRNA active carrier? Asensor? Array (miRNA? Sensor? Based? AAV? Vector? Array, based on a biosensor for detecting activity of miRNA AAV vector, and the activity of miRNA cells) in different cell characteristics of spectrum detection, miRNA spectrum of activity detection and external factors (such as drugs, the application of transgenic) cell miRNA activity spectrum effect etc.. MiRNA Asensor miRNA Array consists of control, Asensor, and a variety of miRNA Asensor sequences that carry miRNA target sequences, which are arranged in a certain order. Control? Asensor and miRNA? Asensor were included Gluc (Gaussia? Luciferase) and Fluc (Firefly? Luciferase) two expression independent units, of which Gluc used to detect the activity of miRNA, Fluc is used to calculate the miRNA? Asensor transduction coefficient, correction of different miRNA difference between Asensor infection?. When in use, the cells to be detected were added to the prepared miRNA Asensor Array, and the expression of Gluc was detected after a period of time, and the miRNA activity spectrum in the cells was calculated according to the transduction coefficient. This method provides a new choice for the study of the production of miRNA activity spectrum and its influencing factors.

【技术实现步骤摘要】
基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用本专利技术属于生物技术专利
是我们申请的中国专利”AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号200910009059. 6)”和”携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途(申请号200910223723. 7)”的延续和扩展。本专利技术具体涉及一种基于AAV (Adeno-associated virus)载体的高通量miRNA活性检测方法miRNA AsensorArray (miRNA sensor based AAV vector Array，基于 AAV 载体的、用于 miRNA 活性检测的生物传感器)及其在细胞miRNA活性谱检测、不同细胞特征miRNA活性谱检测和外界因素(如药物、转基因)对细胞miRNA活性谱的影响等方面的应用。miRNA Asensor Array由不携带miRNA祀序列的control Asensor和多种携带miRNA祀序列的miRNA Asensor按照一 定顺序排列组成。Control Asensor 和 miRNA Asensor 均包含 Gluc (Gaussia Iuciferase)和Fluc (firefly luciferase)两个独立的表达单元，其中Gluc用于miRNA活性检测，Fluc用于计算miRNA Asensor的转导系数，校正不同miRNA Asensor之间的感染性差异。使用时，将待检测细胞加入到制备好的miRNA Asensor Array中，一段时间后检测Gluc表达情况并根据转导系数计算出细胞中miRNA活性谱。该方法为细胞miRNA活性谱的制作及其影响因素研究提供了新的选择。背景miRNA (microRNA)是生物体内源的长度为18 25个核苷酸的非编码RNA (BartelDP. MiRNAs :genomics，biogenesis，mechanism，and function. Cell，2004，116 (2)281-297.) o目前，在人类中已发现1000多种miRNA (参见www. mirbase. org数据库)。在体内，miRNA 与 AGO 等蛋白形成 RISC (RNA Induced Silencing Complex)，识别并结合 mRNA3’ UTR的靶序列，降低mRNA的稳定性和抑制翻译，在转录后水平上对基因的表达进行负调控(Doench JG,Sharp PA. Specificity of microRNA target selection in translationrepression. Genes Dev，2004，18 (5) :504-511.)。研究发现，miRNA 参与人类大约三分之一基因的表达调控(Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, oftenflanked by adenosines， indicates that thousands of human genes are microRNAtargets. Cell，2005，120 (I) :15-20.)，在细胞分裂(Careton M，Cleary MA, LinsleyPS.MicroRNAs and cell cycle regulation. Cell Cycle，2007，6(17) :2127-2132.)、分化(Iovino N，Pane A，Gaul U. miR-184has multiple roles in Drosophila femalegermline development. Dev Cell，2009，17 (I) 123-133.)、死亡(Ambros V. MicroRNApathways in flies and worms growth, death，fat，stress，and timing [Erratum Cell，2003,114(2) :269].Cell，2003，113(6) :673-676.)、凋亡(Jovanovic M, HenqartnerMO. miRNAs and apoptosis RNAs to die for. Oncogene，2007，25(46) :6176-6187.)、新陈代谢(Dang CV, Le A，Gao P. MYC-induced cancer cell energy metabolism andtherapeutic opportunities. Clin Cancer Res，2009，15 (21) ;6479_6483.)以及干细胞的分化(Xu N，Papagiannakopoulos T，Pan GJ，et al. MicroRNA-145regulates 0CT4，S0X2，and KLF4and represses pluripotency in human embryonic stem cells. Cell，2009，137(4) :647-658.)、肿瘤的发生(Schichel R，Boyerinas B，Park SM，et al. MicroRNAs key players in the immune system,differentiation,tumorigenesis and cell death.Oncogene, 2008, 27 (45) :5959-5974.)等诸多生理病理过程中发挥重要作用。目前已建立 Northern blot、QRT-PCR> microarray 和 Deep sequencing 等多种miRNA表达水平检测方法。按照检测原理的不同，这些方法可分为基于杂交的Northernblot和microarray、基于扩增的QRT-PCR和基于测序的Deep sequencing三大类。虽然这些方法可以简单、快捷和高通量地检测细胞内的miRNA表达水平，但是由于这些方法均需要提取细胞内RNA，因此不仅操作繁琐，还不能对同一细胞进行长期持续地监测。更为重要的是，已有的研究表明，细胞内miRNA的活性，即细胞内发挥效应的miRNA，不仅与细胞内miRNA的表达水平相关，还受到miRNA在细胞内的定位、miRNA的稳定性以及miRNA形成 的 miRISC 中其他蛋白因子的影响(Krol J, Loedige I, Fillipowicz ff. The widespreadregulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nature Reviews Genetics,2010,11 :597-610.)。因此为了了解细胞内miRNA活性，需要建立一种检测细胞内miRNA活性的方法。现有的miRNA活性检测方法基于miRNA抑制细胞内基因表达的原理，选择常用的报告基因(Flue、EGFP, RFP、Gluc和Mluc等)，在其3’ UTR区插入某种miRNA的靶序列(如和成熟miRNA完全互补的序列)，同时以3’UTR区不含miRNA靶序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于AAV载体的、用于高通量地检测活细胞的miRNA活性的miRNA活性检测阵列的检测技术方法。2.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNAAsensor，其特征在于，其基因组中包含Fluc和Gluc两个独立的表达框，且表达框间被绝缘子序列分隔，其中Fluc表达框用于校正不同miRNAAsensor间的转导效率差异，Gluc表达框用于探测细胞内miRNA活性。3.根据权利要求2，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，病毒感染校正单元中的Fluc的表达水平与Gluc的表达水平有平行线性关系，miRNA活性检测单元中的Gluc的表达水平与miRNA活性有平行线性关系。4.根据权利要求I，为校正miRNAAsensor间的转导效率差异，我们以Fluc的表达水平来表示miRNA Asensor的转导效率的高低,提出了转导系数(Transduction coefficient,TC)的概念，用转导系数表示miRNAAsensor间的转导效率的高低，这样，可以有效地量化miRNA Asensor转导效率的高低,校正因不同miRNA Asensor转导效率差异而导致的miRNAAsensor Array 测量误差。5.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNAAsensorAr...

【专利技术属性】
技术研发人员：董小岩，田文洪，吴小兵，董哲岳，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：