本发明专利技术涉及一种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及一种BK病毒的检测方法及其试剂盒。本发明专利技术的检测方法包括以下步骤：首先针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P，Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团；然后处理待测样本，进行PCR反应；最后通过荧光定量PCR仪检测反应结果。本发明专利技术的检测方法可进行定性、定量检测，具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势。本发明专利技术还涉及BK病毒的检测试剂盒及其应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及一种BK病毒的检测方法及其试剂盒。
技术介绍
BK病毒(BKV)是多瘤病毒(Polyomaviruses)的一种，原发感染多发生在儿童时期，成人BK病毒血清阳性率高达80%以上。原发感染后病毒以潜伏状态主要存在于肾脏组织及尿道上皮组织中，另外淋巴组织及肝、肺、眼、脑等也有潜伏病毒的存在。免疫正常的人群无症状，当宿主免疫功能降低或受到抑制时病毒可以重新激活复制，并且致病。器官移植后长期服用抗排斥药物(免疫抑制剂)导致患者免疫功能低下是BK病毒激活复制的主要诱因。6 10%的肾移植患者因BK病毒感染可致BK病毒相关性肾病(BKVAN)，50 70%的BKVAN患者最终会移植失败。BKVAN已成为肾移植术后最严重的并发症及影响肾移植长 期疗效和功能的关键因素之一。BK病毒的感染还与骨髓移植患者的出血性膀胱炎，进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等有关。目前临床上对BK病毒相关性肾病最有效的治疗方式就是早期诊断，从而控制抗排斥药物(免疫抑制剂)的用量，同时配合抗病毒药物(如西多福韦)的使用。所以，BK病毒感染的早期诊断对肾移植患者预后具有重要的临床意义。BK病毒相关性肾病(BKVAN)诊断的金标准是肾组织活检。由于BKVAN病灶的局限性导致准确取样困难，灵敏度会受到影响。并且肾组织穿刺带有创伤性，不易被病人接受。同时肾组织活检还要排除急性排斥反应，药物毒性和其他潜在疾病的影响。患者BK病毒激活复制后尿液首先表现为病毒尿症，可通过尿液decoy细胞镜检判断。decoy细胞为来源于尿道上皮的脱落细胞，显微镜下可见核内病毒包涵体及细胞病变效应。但这种方法受限于尿液病理差异及尿道结构的个体差异，结果判定主观，难以做到标准化。国外有研究定量检测移植患者尿液及血液中BK病毒载量，用于BKVAN的预测及治疗监测，显示了很好的效果。国内对BK病毒的研究才刚刚起步，没有成熟的BK病毒检测试剂盒。我国器官移植发展迅速，2009年移植病例数已达10000例，居世界第二位，肾移植最多，占总数的60%以上。其中BK病毒感染所致的BKVAN已成为影响移植成败的关键因素之一。综上亟需能够实现快速、有效且准确检测BK病毒的产品，以用于BK病毒载量的检测，BKVAN的预测及治疗监测。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种用于检测BK病毒的方法；本专利技术的第二专利技术目的在于提出检测BK病毒的试剂盒；本专利技术的第三专利技术目的在于提出该检测BK病毒试剂盒的应用。为了完成本专利技术的目的，采用的技术方案为本专利技术涉及一种BK病毒的检测方法，包括以下步骤(I)针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P，Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团，优选为3’端；(2)处理待测样本，进行PCR反应；(3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果；其中，BKV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；BKV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；BKV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列 经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。其中，SEQID NO 1 的核苷酸序列为 AGAACTGCTCCTCAATGGATG ；SEQ ID NO 2 的核苷酸序列为 AGCTGCCCCTGGACACTCT ；SEQ ID NO 3 的核苷酸序列为 TGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCA。本专利技术的第一优选技术方案为，所述的Taqman突光探针的突光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基_4’，5’ - 二氯_2’，7’ - 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂I、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’- 二氯_2’，7’- 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂I时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - 二氯_2’，7’ - 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5. 5中的一种。最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM ;所述荧光淬灭基团为BHQl。本专利技术的第二优选技术方案为，步骤(2)中PCR反应的反应体系包括PCR反应液19.8“1、0嫩聚合酶0.2“1、待检模板5.(^1 ；其中，PCR反应液的组成为10X反应缓冲液2. 5μ I, BKV-F (10 μ Μ) O. 5 μ I,BKV-R(IOyM)O. 25 μ 1，BKV-P (10 μ Μ) O. 5 μ I, dNTP 2. O μ 1，最后用无菌超纯水将反应体系补至 19. 8 μ I。本专利技术的第三优选技术方案为步骤⑵中PCR反应的反应条件为92 95°C，3 5分钟；然后92 95°C，10 15秒，55 65°C，10 35秒，共40个循环；优选94°C，4分钟；然后94°C，15秒，60°C，35秒，共40个循环。本专利技术的第四优选技术方案为所述的PCR反应均设置阴性质控组和BK病毒定量标准品I IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，BK病毒定量标准品I-IV的待测模板分别为BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。本专利技术的第五优选技术方案为BKV定量标准品I IV的构建方法包括以下步骤(I)配制检测反应体系，加入提纯的病毒基因组，进行PCR反应；(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，重组质粒转化细菌后扩增； (3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5X IO5 5X 108copies/ml，分别作为试剂盒的BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。本专利技术的第六优选技术方案为所述的待测样本的处理方法包括磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化铵法。本专利技术的第七优选技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种BK病毒的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤 (1)针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P，Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意ー个位置上标记有淬灭基团，优选连接于3’端； (2)处理待测样本，进行PCR反应； (3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果； 其中，BKV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO :I所示，或由SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； BKV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； BKV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少ー种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂I、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少ー种； 优选的，当荧光淬灭基团选自4- (4- ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸吋，荧光报告基团选自6-羧基突光素、四氯-6-羧基突光素、6-羧基-4’, 5’- ニ氯-2’, V - ニ甲氧基突光素玻珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂I吋，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2吋，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3吋，荧光报告基团选自花菁5或花菁5. 5中的ー种；最优选的，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂I。3...
【专利技术属性】
技术研发人员：石炳毅，钱叶勇，蔡明，宋玉亮，韩永，王新颖，范宇，解俊杰，叶锋，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇九医院，北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。